COURS 3.

MÉTHODE D’ÉTUDE DU VIVANT: DE LA

MOLÉCULE À L’ORGANISME
Module de Méthodologie de travail
1ere année Licence SNV Présenté par:
Université de Béjaia (2021/2022) Dr. Fatima BENAISSA
(MCA à UAMB)
Méthodes d’investigation
Tout travail d’investigation passe par différentes étapes :
ü Définir ses objectifs;
ü Déterminer une problématique ;
ü Définir ses hypothèses;
ü Etablir une bibliographie;
ü Choisir une méthodologie à appliqué;
ü Construire un plan de travail;
ü Collecter les données;
ü Exploiter les données;
ü Rédiger un document scientifique
Introduction
Les méthodes scientifiques ou méthodes expérimentales sont un
ensemble de règles à suivre pour réaliser des expériences et vérifier
des théories.

Elles permettent de décrire, de comprendre, d'expliquer et d'évaluer

un phénomène biologique ou autre.
Tout objet ou sujet d'étude utilise une méthode .

Une méthode : signifie un raisonnement logique, c'est un ensemble

de démarches ou de procédures qui permettent de découvrir et de
démontrer une certaine réalité (vérité); Il s’agit du chemin qui mène
au but recherché.

Ces démarches utilisent différentes techniques et approches

méthodologiques pour mener à bien des activités de recherche.
Choisir une méthode:
Critères à retenir pour orienter le choix d’une méthode d’investigation:
ü l’importance des moyens que nécessite le travail à réaliser.
ü Lister les avantages et les inconvénients de chaque méthode
utilisable.
ü Choisir la méthode dont le rendement sera le meilleur .

Différentes méthodes proposées par les chercheurs:

ü Méthodes d’étude du passé des êtres vivants
ü Méthodes basées sur l’observation directe: On parle d’observation
lorsqu’un chercheur va sur le terrain et constate par lui-même les
faits. Il recueille ses observations en prenant des notes, ou en
utilisant une technique d’enregistrement audio ou audiovisuelle.
ü Méthodes basées sur des statistiques: Prévisions dans le futur.
Méthodes d’étude de passé des être vivants
Paléontologie: étude des êtres disparus
La paléontologie qui étudie:
ü Les animaux : c’est la paléozoologie
ü Les végétaux : c’est la paléobotanique
ü La science qui étudie les relations des êtres vivants fossiles avec leur
milieu de vie est la Paléo écologie issue de la paléontologie.
Palynologie: étude du grain de pollen et des spores actuels ou fossiles
Pédoanthracologie : étude des micro-charbons de bois extraits du sol.
Dendrochronologie : datation du bois par les variations d’épaisseur des
cernes.
Paléomalacologie : étude des coquilles de gastéropodes contenues
dans les sols et les sédiments:
Paléoentomologie : étude des restes d’insectes fossiles:
Plan
I. Étude à l’échelle de la cellule
1. Méthode d’étude de la structure
2. Méthode d’étude du fonctionnement cellulaire
II. Étude à l’échelle infra-cellulaire
1. Fractionnement des composants de la cellule
2. Séparation et caractérisation des constituants chimiques
3. Étude de la structure dans l’espace de grosses molécules
4. Étude chimique fine
5. Synthèse et amplification
III. Étude à l’échelle de l’organisme et des tissus
1. Étude de la structure
2. Étude du fonctionnement
IV. Étude à l’échelle d’un écosystème
I.1. Méthode d’étude de la structure (Étude au microscope)
Principe général : étude par transparence, donc généralement sur des coupes
minces, exceptionnellement sur des cellules isolées, en particulier pour les
procaryotes.
Phase de traitement du matériel vivant avant l’observation, pour obtenir du matériel
fixé : Quel que soit le type de microscope utilisé, il y a successivement :
ü fixation (évite les altérations),
ü inclusion dans la paraffine,
ü coupe, coloration.
Ces traitements permettent l’observation des cellules et des tissus, avec des risques
d’artefacts.
Microscope optique
Microscope photonique

le microscope photonique, utilisant la lumière. Ses particularités sont :

ü Possibilité dans certains cas d’observer du matériel vivant.
ü Coloration spécifique de certains composés chimiques.
ü Utilisation de la fluorescence et de l’immunolocytologie.
Microscope électronique (MEB/MET)
Microscope électronique (MEB/MET)

Certaines techniques sont propres à ce microscope comme :

- Nécessité d’une déshydratation totale du matériel.
- Coupe extrêmement fines (1/200 de l’épaisseur de la cellule) après inclusion
dans des résines.
- Coloration avec des sels de métaux lourds qui se fixent sur certains constituants
de la matière vivante (par exemple osmium sur les lipides).
- L’image obtenue est en noir et blanc : les métaux lourds font apparaître en noir
sur l’image obtenue, les zones où ils se sont fixés.
Différentes techniques (scanner, microscope à balayage, cryodécapage)
permettent d’obtenir des images en 3-D.
Comparaison Microscope (optique / électronique)
Microscope optique Microscope électronique

Matériel Vivant ou non Non vivant

Caractérisation des Colorants, coupes Métaux lourds, coupes noir et

composants colorées blanc (coloration artificielle)

Epaisseur des coupes 1 à 10 µm (1000 à 10000 50 à 100 nm

nm)
Image en 3D non Scanner, microscope à
balayage, cryodécapage
I.2. Méthode d’étude du fonctionnement cellulaire
L’étude peut être menée en continu, mais elle est souvent faite en
bloquant le métabolisme à des moments différents pour des lots de
cellules comparables.
Il est alors important de tuer la cellule rapidement (congélation, alcool
bouillant, fixation chimique par exemple) pour éviter toute
modification chimique des constituants.
I.2.1. Utilisation des isotopes
Ils permettent de suivre le devenir d’un atome au cours des réactions
chimiques d’une cellule.
Deux type d’isotopes sont utilisés :
ü Les isotopes lourds: 18O au lieu de 16O15N au lieu de 14N, etc.
Comme ils sont plus lourds que l’isotope courant, leur présence et
leur abondance sont détectées au spectrographe de masse.

ü Les radio-isotopes :
Etant instables, ils se désintègrent en émettant un rayonnement que
l’on peut mesurer.
L’intensité du rayonnement (et donc le nombre d’atomes de radio-
isotopes fixés) peuvent être mesurés par compteur Geiger amélioré, par
scintigraphie, ou par autoradiographie.
I.2.2. Utilisation d’anticorps spécifique
Ils permettent de détecter la présence et la localisation précises de molécules complexes

La préparation des anticorps utilisés comportent plusieurs étapes :

ü La molécule M à rechercher est injectée à un Vertèbre (ex le lapin);
ü cette molécule (étrangère pour le lapin), déclenche la production
d’anticorps anti-M dans le sang du lapin ;
ü les anticorps sont récupérés et purifiés ;
ü les anticorps sont « marqués » par une substance qui les rend
repérables lors de leur utilisation ultérieure ;
ü on met en contact les anticorps marqués et les cellules (le plus
souvent sur coupe) pour lesquelles on cherche à détecter M ;
ü on lave de façon à entrainer les anticorps non fixés sur la coupe.
Si la coupe contient la molécule M, les anticorps s’y sont fixés et
rendent M repérable.
I.2.3. Micro injection dans une cellule
Des substances peuvent être injectées dans la cellule.
On peut suivre leur déplacement (à l’intérieur ou non d’un même
compartiment, sortie de la cellule, passage directe d’une cellule à
l’autre par des jonctions gap par exemple).
I.2.4. Étude de l’état ionique de la cellule
ü Des microélectrodes réceptrices permettent de mesurer l’état
électrique de cellule et de ses modifications.
ü Des microélectrodes excitatrices permettent de modifier l’état
électrique de la cellule.
ü Des changements ioniques brutaux peuvent être mis en évidence
par l’utilisation de substances devenant fluorescentes en présence
de certains ions (æquorine qui devient fluorescente en présence
de Ca2+).
ü Des micropipettes aspiratrices retiennent un fragment et
permettent l’étude des courants ioniques à ce niveau de
membrane (patch clamp).
II. Étude à l’échelle infra-cellulaire
Ces techniques concernent les ultrastructures, les organites et les grosses
molécules.
II.1. Fractionnement des des composants de la cellule

Il comporte plusieurs étapes :

- un broyage,
- une succession de centrifugation dont chacune permet de séparer
un surnageant et un culot,
- séparation des plus fines à très haute vitesse (grande accélération
centrifuge = ultracentrifugation) et sur gradient de densité, avec
réfrigération, sous vide.
II.2. Séparation et caractérisation des constituants chimiques

Différentes méthodes peuvent êtes utilisées :

ü la chromatographie, surtout sur les petites molécules : sur papier, sur

colonne ou en phase gazeuse, (HPLC, GC-MS)

ü l’électrophorèse pour séparer les molécules chargées (protéines,

acides nucléiques).

ü Ces deux techniques peuvent être utilisées en une ou en deux

dimension, et peuvent se combiner.
Les techniques de repérage sont les mêmes que pour les cellules
entières.
Sohxlet
II.3. Étude de la structure dans l’espace de grosses molécules

ü Elle peut être faite aux rayons X (ADN, protéines).

ü Séquençage.
DRX
II.4. Étude chimique fine
ü Certaines enzymes : certaines coupent les macromolécules en
des sites particuliers (enzymes de restriction pour les ADN, endo-
peptidase pour les protéines).

ü Il existe maintenant des systèmes automatiques d’analyse

permettant de connaître la séquence des acides aminés sur une
protéine ou celle de nucléotide sur un acide nucléique.
II.5. Synthèse et amplification
PCR (Polymerase Chain Reaction) pour l’ADN « réaction de
polymérisation en chaines » d’un fragment d’ADN.
Elle permet, in vitro, « d’amplifier » un même fragment d’ADN, c’est à
dire d’en obtenir un très grand nombre de copies, fragment dont on
peut ne posséder qu’un nombre infime d’exemplaire au départ.
Les grandes quantité d’ADN obtenues rapidement permettent en
suite l’utilisation des techniques d’électrophorèse.
3. Étude à l’échelle de l’organisme et des tissus
Les études anatomiques concernent les organismes morts.
Pour les organismes vivants, les méthodes suivent les mêmes
principes pour les animaux et les végétaux, mais, compte tenu de
l’intérêt médical ou vétérinaire, elles sont surtout utilisées chez
l’Homme et chez les animaux.
3.1. Étude de la structure
ü radiographie : l’opacité aux rayons X est variable suivant la densité
du tissu. Cette opacité peut être augmentée par l’absorption ou
l’injection d’éléments lourds (celles de baryum).
ü Échographie : réflexion des ultrasons par les parties denses de
l’organisme.
ü Tomographie, scanner : balayage systématique par un faisceau à
focalisation ponctuelle permettant une mesure de l’absorbance par
point dans l’espace. Un logiciel permet d’obtenir des images en 2D
et 3D avec des fausses couleurs.
ü RMN (résonance magnétique nucléaire) : liée aux propriétés
électromagnétiques des atomes ou des ions soumis à un champs
magnétique intense et périodique. Les tissus donnent un signal
différent en fonction de leur teneur en eau ou certains éléments
(32P par exemple).
3.2. Étude du fonctionnement
ü Thermographie : images obtenues par des caméras sensibles aux
infrarouges. Ces images sont amplifiées et traduites en fausses
couleurs (rouge pour les zones chaudes, bleu pour les zones
froides : voir la couverture).
ü Scintigraphie : détection de rayonnement d’un produit radioactif
injecté dans l’organisme et fixé par un tissu ; on utilise le Xénon
(133Xe) pour les poumons, et l’iode (123I ou 131I) pour la thyroïde ...
ü Mesures de phénomènes électriques : électrocardiogrammes
(ECG), électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme
(EMG)...
3.2. Étude du fonctionnement
ü TEP (Tomographie par émission de positons, ou on dit aussi
positrons) : les positrons sont des électrons positifs, nommés aussi
ß+, émis après l’injection de composés marqués par des isotopes
artificiels de durée de vie très courte comme le 11C, 13C, 15O... Les
images sont aussi données en fausses couleurs, avec un code
conventionnel. Utilisée pour des mesures de débit et de
métabolismes locaux, sans risque pour l’organisme compte tenu
de la durée de vie très coute de l’isotope et des faibles énergies
des ß+.
4. Déroulement d’une expertise écologique
1. Plan d’échantillonnage : un protocole comprenant un plan
d’échantillonnage permettant d’organiser la collecte des données sur
des bases scientifiques (représentativité);
2. Recensement: un recensement du patrimoine naturel:
aucune méthode ne pouvant à elle seule fournir toutes les données
souhaitées, on utilisera un ensemble de méthodes complémentaires
apportant une connaissance aussi exhaustive que possible.
3. Analyse de données pouvant comporter des traitements statistiques,
et parfois complétés par des indices traduisant la richesse biologique,
l’intérêt ou la qualité de l’écosystème étudié;
4. Interprétation des résultats
Pour être aussi objective que possible, l’évaluation doit se fonder sur
des comparaisons à des systèmes de référence clairement décrits et
selon des critères bien définis.
4.1.1. Échantillonnage systématique
4.1.2. Échantillonnage aléatoire
4.1.3. Échantillonnage stratifié
4.1.4. Transect
L’échantillonnage selon un transect consiste à réaliser des relevés ou
inventaires soit selon un parcours prédéterminé dans un milieu
visuellement homogène, soit le long d’une ligne choisie de manière à
représenter un gradient de l’environnement.
4.2.1. Méthodes qualitatives
Ces méthodes permettent d’établir des listes d’espèces recensées
sur un site et ses différents secteurs, en général parmi quelques
groupes cibles : flore, oiseaux, papillons, libellules, etc. En revanche,
elles ne renseignent pas sur l’abondance des populations ;
4.2.2. Méthodes qualitatives
Ces méthodes s’appuient sur des comptages directs (taille de la
population) ou sur des estimations. Elles fournissent à la fois des
listes d’espèces et des données chiffrées sur l’abondance de ces
espèces, exprimées selon des indices ou des densités.

Ces méthodes sont pratiquées selon des protocoles précisant le

type de données à récolter (contacts, captures, traces, ...) ainsi que
les périodes de passage, le matériel utilisé, etc. ;