Techniques de Laboratoire 01

TECHNIQUES DE
LABORATOIRE
DR. MELAKHESSOU MOHAMED AKRAM
TECHNIQUES DE LABORATOIRE Dr. Melakhessou Mohamed Akram
I. La microscopie
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures à
l’échelle microscopique. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la
préparation et émise ensuite par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre
et passe par un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit observée à l’œil nu, soit
photographiée, soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour retraitement.
Le but du microscope est de donner accès à la structure microscopique des objets observés. Un
microscope sert donc à voir des détails plus fins de l'objet et pas seulement à en faire une image
agrandie. La performance principale de cet instrument est donc sa résolution, c'est-à- dire sa
capacité à séparer ces détails.
Figure 1. Les champs d’utilisation des microscopes
1.La microscopie électronique

Les microscopes électroniques utilisent des faisceaux d’électrons qui se déplacent selon une
onde (comme la lumière). Lorsque le flux d’électrons est accéléré, la longueur d’onde diminue
et la résolution augmente. Il existe deux types de microscope électronique regroupés dans le
tableau qui suit.
Les types Utilisation permet :
Le microscope électronique a transmission La transmission de l’image par des faisceaux

(MET) d’électrons.
Le microscope électronique à balayage (MEB) La formation de l’image de l’ultrastructure

cellulaire en relief.
1.2. Microscope électronique à transmission
1.2.1. Principe du fonctionnement

Le fonctionnement du microscope électronique à transmission (MET) est basé sur l’émission
des électrons de longueur d’onde courte qui seront, au cours de leur trajet, convertis en rayons
lumineux de longueur d’onde plus longue Il est comparable à celui du microscope photonique.
La source S est une cathode chargée négativement qui émet des électrons (au lieu des photons)
qui sont accélérés par l’application d’une différence de potentiel entre la cathode et l’anode. Le
vide poussé à l’intérieur du M’est nécessaire au déplacement des électrons. Les électrons
traversent 3 lentilles électromagnétiques L1, L2, L3 et l’objet.
- L1 : le condenseur de la même charge qui permet de focaliser le flux d’électrons sur l’objet.
- L2 et L3 jouent le rôle d’objectif et permettent l’agrandissement de l’objet.
Figure 1 : Principe de fonctionnement du microscope optique et électronique à transmission

1.2.2. Caractéristiques des électrons
Les avantages majeurs du rayonnement électronique sont
- sa faible longueur d’onde, faible taille et masse ce qui lui permet de donner une résolution
excellente. - Les sources électroniques sont aussi très brillantes, ce qui permet d’obtenir une
forte densité de particule dans un faible volume.
- De plus, ces particules interagissent fortement avec la matière.
1.2.3. Les composants de MET
✓ Le canon à électrons
- pour produire les électrons Le filament de tungstène est chauffé et est maintenu à un voltage
négatif de 1 à 50 kV par une cathode chaude (3000°C effet thermoïonique).
- Le Wehnelt qui est un cylindre autour de la pointe est légèrement polarisé négativement (entre
0 et 200 V) par rapport à la cathode, ce qui fait converger ou focaliser les électrons vers une
région de diamètre (do) appelé le cross-over.
- Les électrons sont ensuite excités et accélérés par la forte tension d'une anode positive (jusqu'à
200 kV).
Figure 2 : Le canon à électrons

✓ Lentilles électromagnétiques
L’action d’un champ magnétique sur une particule chargée, de charge q et de vitesse v est
l’équivalent de l’optique traditionnelle mais appliquée aux particules chargées.
- Pour obtenir une lentille électromagnétique, on utilise une bobine torique parcourue par un
courant électrique qui engendre un champ magnétique axial (chargé négativement) ou Le
faisceau électronique est dévié vers l'axe (cas d'une lentille convergente) tout en subissant un
mouvement de rotation autour de l'axe.
- Ou un champ radial (chargé positivement) Le faisceau électronique est dévié vers l’extérieur.
Figure 3 : Lentilles électromagnétiques
✓ Lentilles 1 (condenseur)
Elle permet de condenser les électrons en un faisceau d’électrons sur quelques nm jusqu'à 0,1
mm de la surface de l'objet. Plus la tache électronique est réduite, plus l'analyse est précise et
le grandissement du microscope élevé.
✓ Lentille-objectif
Le faisceau d'électrons traverse l’échantillon, et ressort avec des informations sur la structure
de l'échantillon. Ces informations sont ensuite amplifiées par le système de lentilles objectif du
microscope.
✓ Lentilles Projecteur
Elles récoltent les électrons et les convertit en photons afin que les électrons deviennent visibles
sur un écran fluorescent (le rayonnement électronique n’est pas visible). L'image détectée est
dirigée vers un ordinateur.
1.2.4. Préparation des coupes cellulaires ultrafines
Les cellules doivent être coupées en tranches très fines (50 à 100 nm) pour permettre aux
électrons de les traverser, pour cela :
✓ Les cellules sont tuées par des fixateurs (glutaraldéhyde) qui préservent les
structures cellulaires.
✓ Les échantillons fixés sont lavés dans l’eau, puis déshydratés par des solvants
organiques (acétone).
✓ Les échantillons sont inclus dans un bloc de résine ou plastique
✓ Les blocs de résine renfermant l’échantillon sont ensuite coupés à l’aide d’un
ultra microtome (qui est un appareil de très grande précision qui permet des
coupes de 80 à 100 nm d'épaisseur) muni d’un couteau de verre ou de diamant.
Les coupes cellulaires sont recueillies sur une grille en cuivre. La grille est trempée dans une
solution de métaux lourds (uranium, plomb) pour noircir les structures cellulaires et augmenter
le contraste (des liaisons s'établissent entre les membranes et le métal imperméable aux
électrons.
Figure 4. Résumé de la méthode de préparation des coupes.
2. Le Microscope Electronique à Balayage (MEB)
Est un outil d'observation de la topographie des surfaces. Il apporte des informations sur la
structure et la texture d’un échantillon et donne des images proches d’une image en trois
dimensions. Le microscope électronique à balayage est principalement constitué de :
- Des détecteurs d’électrons.
-Un système de visualisation d’image couplé de manière synchrone au même générateur de

balayage.
2.1. Préparation des échantillons
Le but de la préparation d’un échantillon pour le MEB est de produire un objet qui conserve la
forme et les propriétés superficielles du vivant, mais qui est totalement déshydraté, en vue de
l’observation sous vide.
Principe
Il est basé sur l'augmentation du contraste (non pas l'échantillon mais l'espace qui l'entoure)
par utilisation de produits imperméables aux électrons comme l’acide phosphotungstique. Ce
qui produit une image en négatif.
2.2. Etapes de la technique
Les différentes étapes de la technique de la coloration négative sont résumées comme suit :
o Préparation de la solution constituée de l’échantillon et de l’acide

phosphotungstique (2%).
o Dépôt d’une goutte de ce mélange sur la grille porte objet recouverte d'une
membrane ayant de l'affinité avec l’acide phosphotungstique (des liaisons
s'établissent entre la membrane et l’acide phosphotungstique imperméable aux
électrons).
o Laisser sécher de manière ou l’acide phosphotungstique ne se retrouve que sur
la surface de la membrane, autour de l'échantillon mais pas au-dessus de ce
dernier. Les électrons qui arrivent sur la surface de la membrane recouverte
d'acide phosphotungstique seront retenus ; par conséquent, l’échantillon aura un
aspect clair sur un fond très dense.
2.3. Diffusion des électrons
Il existe deux cas
o Un électron primaire du faisceau incident entre en collision avec l'échantillon.

Quand il interagit avec les électrons d'un atome, il ressort avec perte d'énergie.
Un électron secondaire est émis, l'atome est ionisé et devenu claire. C'est le
processus d'interaction ou diffusion inélastique.
o Un électron primaire du faisceau incident entre en collision avec l'échantillon. Il
ressort sans perte d'énergie il s’appelle un électron rétrodiffusé (il n'a pas
échangé d'énergie avec les atomes de l'échantillon). C'est le processus
d'interaction ou diffusion élastique. L'électron incident est rétrodiffusé
élastiquement.
2.4. Détecteur
Ce détecteur est entouré, pour sa partie récoltante, d'une cage électrique attirant les électrons
considérés Les interactions électrons primaires échantillon génèrent des signaux sous formes
d’électrons désexcitâtes (secondaires). Cette désexcitation de ces électrons se traduit par des
rayons lumineux sous forme d’image construite sur l’écran luminescent.
Spectroscopie UV-Visible
1.Spectroscopie UV-Visible
La technique de spectrophotométrie est basée sur la propriété de la matière, et plus

particulièrement de certaines molécules, d’absorber certaines longueurs d’ondes du spectre UV-
visible. Elle permet de réaliser des dosages grâce à la loi de Beer-Lambert (A= ε l C), qui montre
une relation de proportionnalité entre l’absorbance et la concentration, aussi bien qu’une étude
structurale des complexes par l’étude des spectres d’absorption. Cette méthode est basée sur
l’utilisation d’un spectrophotomètre qui détermine l’absorption d’une solution pour une
longueur d’onde donnée ou pour une plage de longueurs d’ondes judicieusement choisie.
est le coefficient d'atténuation molaire ou d'absorptivité propre à l'entité chimique
2.Domaine UV-Visible
Dans une molécule, les transitions électroniques ont lieu dans la région de l’ultraviolet et du
visible.
Le domaine UV-visible s'étend environ de 10 à 800 nm.
• Visible : 400 nm -800 nm.
• Proche-UV : 200 nm -400 nm.
• UV-lointain : 10 nm- 200 nm.
Pour les appareils usuels, les domaines utiles de longueur d’onde dans les domaines UV-
Visible sont :
UV Visible
200 nm < λ < 400 nm 400 nm < λ < 800 nm
3.Appareillage
Le spectrophotomètre UV-visible est constitué des éléments suivants :
➢ Source de lumière monochromatique :
Visible : Lampe à incandescence à Tungstène et iode.
UV : Lampe à arc à Deutérium ou à Xénon, ou mercure.
➢ Monochromateur (sélection de la longueur d’onde)
Prisme
Réseau
➢ Cuve
Visible : Verre
UV : Quartz
➢ Détecteur = Photomultiplicateur ou photopiles
Les différentes configurations des spectromètres UV/VIS :
➢ Spectromètres à optique monofaisceau, de type monocanal.

➢ Appareils à optique inversée, de type multicanaux.
➢ Spectromètres à optique double faisceau (type séquentiel).
4. PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
La spectroscopie UV-Visible se réalise à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la cuve

contenant la solution est placée dans un spectroscope, elle reçoit un rayonnement d'intensité
I0. Une partie de cette lumière incidente notée I0 est absorbée par le milieu et le reste, noté I,
est transmis. L'intensité (I) du rayonnement issu de la cuve est donc inférieure à l'intensité du
rayonnement initial (I0). La fraction de la lumière incidente absorbée par une substance de
concentration C contenue dans une cuve de longueur l est donnée par la loi de Beer-Lambert :
A = log(I0/I) = ε l C.
Schéma de principe de lecture d'un échantillon en spectroscopie UV-visible
5. Allure du spectre d’absorption UV-visible : A = f (λ)
• Spectre UV-visible : tracé de l’absorbance en fonction de la longueur d’onde (usuellement

exprimée en nm).
• Bande caractérisée par position λ max, son intensité reliée au coefficient d’extinction molaire
εmax.
6.APPLICATIONS DE LA SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE
✓ Analyse qualitative
Les spectres UV fournissent généralement peu de renseignements sur la structure moléculaire

des composés.
✓ Analyse quantitative
L’analyse quantitative par la spectrométrie UV-visible est très employée (beaucoup plus que
l’analyse qualitative) grâce à l’utilisation de la loi de Beer-Lambert.
Comme applications, on peut citer :
• Dosage du fer dans l’eau ou dans un médicament.
• Dosage des molécules actives dans une préparation pharmaceutique.
✓ Autres applications
D’autres applications sont connues pour le Contrôle Qualité ou le suivi de la cinétique d’une
réaction, la détermination des constantes de dissociation des acides ou des constantes de
complexation, la détermination des masses molaires…
La centrifugation
1.La centrifugation
La centrifugation est une technique qui permet la séparation des composés d’un mélange en
fonction de leur densité sous l’action d’une force centrifuge. Elle permet de récupérer un
précipité (culot) et un surnageant. Le mélange à séparer peut-être constitué de deux phases
liquides ou de particules solides en suspension dans un liquide.
L’ultracentrifugation utilise des vitesses de rotation encore plus grandes (allant jusqu’à 75000
tours par minute) et permet la sédimentation de particules ultramicroscopiques.
1.1. Principe
La centrifugation permet de séparer des constituants de taille et de masse très différentes

contenus dans un liquide. Les constituants contenus dans un échantillon sont soumis à deux
forces :
La gravité : C’est la force qui s’exerce du haut vers le bas.
La poussée d’Archimède : C’est la force qui s’exerce du bas vers le haut.

Pour une vitesse de rotation donnée, chaque rotor a une force relative de centrifugation en x.g
(force de gravité relative ou accélération) qui peut être exprimée en vitesse de rotation en
rotations par minute selon la formule mathématique de conversion. Celle-ci est :
g = 1.119 • 10-5 • r • N2
où g est la force relative de centrifugation (RCF = Relative Centrifuge Force), r est le rayon de
rotation du rotor (en cm) et N (rotations par minute: rpm) exprime la vitesse de rotation.
2.Types d’ultracentrifugation
Il existe deux principaux types :
2.1. L’ultracentrifugation différentielle
On l'appelle ultracentrifugation différentielle car basée sur la différence de vitesse de

sédimentation des organites, elle-même reposant sur différence de densité des organites ; et
ultra pour désigner les faibles différences (comme pour ultrastructure) et utilisation
d'accélérations importantes.
Le principe de ce type de centrifugation est de séparer les différents constituants à l’aide de

plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une centrifugation à faible
accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube.
Les éléments dont l’accélération est trop faible pour contrebalancer les effets de l’agitation
moléculaire, ou le temps de centrifugation est trop court vont rester dans le surnageant. Cette
méthode est utilisée, par exemple, pour récupérer les éléments (les cellules) du sang qui
sédimentent pour des accélérations très faibles. Exemple : Isolement des organites cellulaires.
Tout d’abord au cours d’une première centrifugation, les constituants les plus lourds sont isolés.
Puis, en augmentant la vitesse de sédimentation les constituants de densité croissante seront
séparés (Figure 7).
Figure 7. Différentes étapes de l’ultracentrifugation différentielle
2.2. L’ultracentrifugation en gradient de densité
Cette technique permet de séparer en une seule fois des organites qui ont des vitesses de
sédimentation très voisines (cf. très faibles différences de densité). On travaille dans un milieu
présentant un gradient de densité, d'où le nom donné à la technique.
Principe :
On a vu précédemment que la vitesse de sédimentation est fonction de la différence (dp - dm),

or quand dp = dm Vsed = 0, l'organite s'immobilise ainsi dans la zone ou couche de gradient de
densité qui correspond à sa propre densité. Les différents organites vont donc s'étager sur toute
la hauteur du tube de centrifugation. Pour obtenir des solutions de densités différentes, deux
gradients peuvent être utilisés, un gradient de saccharose formé préalablement à la
centrifugation, et un gradient de chlorure de césium (CsCl).
Il existe deux types de gradients :
A) Les gradients discontinus

Le gradient est préformé par des dépôts successifs de solution de saccharose de densité
croissante. Les différents éléments s’accumulent aux interfaces entre les solutions de
densité différentes. Au-dessus, leur densité étant plus élevée, ils migrent vers le bas, et au-
dessous, leur densité étant plus faible ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient
à deux densités seulement avec une solution inférieure très dense Centrifugation en
gradient discontinu.
B) Les gradients continus
Ce sont des gradients pour lesquels la variation de densité est continue. Une solution de
CsCl de densité donnée soumise à une force de gravité intense forme spontanément un
gradient de densité continu . Les différents constituants vont alors migrer jusqu’à atteindre
le point précis où leur densité est égale à celle du solvant formant des bandes.
A B
Electrophorèse
1.Définition
Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un

champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine « phorèse »
vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ». L’électrophorèse est donc une
technique d’analyse et de séparation basée sur les critères de la charge électrique et la taille des
molécules. La migration différentielle de particules chargées électriquement, se fait sous
l’influence d’un champ électrique. Seules les particules chargées positivement ou négativement
sont attirées par les pôles opposés du champ.
1.2. Principe
L’électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans un but
analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Le principe consiste à
soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce qui entraîne la migration des
molécules chargées. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme, nature du
support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être variable, ce qui permet
la séparation des différentes molécules.
A partir de ce principe général, il existe plusieurs variantes de cette technique adaptées à

différentes situations.
2-APPLICATIONS
L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines, peptides, acides

aminés, acides nucléiques et nucléotides. Elle permet dans certaines conditions (emploi de
micelles de détergents ioniques) de séparer des molécules non ioniques, comme des hormones
stéroïdes par exemple.
3.Les différents types d’électrophorèses
Le choix du support est dicté par la nature des molécules à séparer et selon le support on
distingue deux types d’électrophorèse :
3.1. L’électrophorèse libre, en veine liquide
est réalisée dans un tube en U de section carrée (ceci afin de pouvoir réaliser des mesures
optiques au travers du tube, comme avec une cuve de spectrophotomètre) : la séparation n'est
pas totale, mais les frontières qui se forment sont mises en évidence par des méthodes optiques
(absorption UV, indice de réfraction, fluorescence...). Cette méthode est utilisée en recherche
pour mesurer la mobilité électrophorétique et pour vérifier la pureté des protéines.
Fig 1 : appareillage pour l’électrophorèse libre, en veine liquide
3. 2. L’électrophorèse sur supports poreux (électrophorèse de zone)

Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide. Le support
doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés.
Différents supports d’électrophorèse de zones :
Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de
support :
o Papier
o Acétate de cellulose
o Semi-solide (gels)
- Différents types d’électrophorèse sur gel :

• électrophorèse sur gel d’agarose
• électrophorèse en champ pulsé
• électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
• électrophorèse bi-dimensionnelle
• Les électrophorèses peuvent aussi être réalisées en conditions dénaturantes (détergents type
SDS ou urée).
A.Électrophorèse sur papier
Assez peu résolutive, cette technique d'électrophorèse est surtout destinée à séparer des
molécules de petite taille, dont les acides aminés. Des phénomènes d'interférence liés à la charge
des acides aminés et de la cellulose du papier interviennent de façon notable. Une goutte de
solution contenant l'échantillon à analyser est déposée sur une bande de papier, puis séchée. La
bande de papier est humidifiée avec un tampon convenablement choisi, puis les deux extrémités
de la bande sont plongées dans deux réservoirs contenant le tampon. Chaque réservoir est
connecté à une électrode. Un champ électrique continu est appliqué, et les acides aminés se
déplacent en fonction de leur charge nette. En fin d'électrophorèse, la bande de papier est séchée
puis les acides aminés sont révélés par une réaction colorimétrique telle que celle à la
ninhydrine.
Fig 2 : appareillage pour l’électrophorèse sur papier.

B.Électrophorèse sur acétate de cellulose :
L'électrophorèse se fait dans des conditions proches de celles de l'électrophorèse sur papier. Les
bandes d'acétate de cellulose sont fragiles, mais elles limitent la diffusion des molécules à
séparer. La révélation des protéines se fait également par une réaction colorimétrique (rouge de
ponceau par exemple). Cette technique, peu résolutive, permet de séparer grossièrement des
groupes de protéines. Elle est peu coûteuse et permet une analyse rapide des protéines sériques.
Fig 3 : appareillage pour l’électrophorèse sur les bandes d'acétate de cellulose.
C-Électrophorèse sur gel d’amidon :
L'électrophorèse sur gel d'amidon est particulièrement utile l'analyse et la séparation des
isoenzymes. Le principe de la technique repose sur une séparation électrophorétique des
protéines sur une matrice poreuse composée d'un gel d'amidon, de pH précis. Les enzymes
présentes sont détectées en incubant le gel dans une solution contenant un substrat spécifique
de l'enzyme donnant lieu à un produit coloré. Les profils obtenus sont désignés sous le nom de
zymogrammes.
D-Électrophorèse sur gel
Sous l'action d'un champ électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse(v)
proportionnelle aux champs :
V = μ E, avec μ appelée « mobilité électro phorétique »
μ en cm2.s-1.volt-1, v en cm.s-1 et E en volt.cm-1 Le champ électrique (E) crée entre

2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on suppose sphérique et de
charge q;
Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (êta) vont s'opposer à la migration de
la protéine et la freiner ;
Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace alors à

vitesse constante ; on peut alors écrire :
On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ

électrique, par la relation suivante :
Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champ uniforme dépend de 3 facteurs : q,
(êta) et r.
Elle est proportionnelle à sa charge (q), inversement proportionnelle au coefficient de viscosité

du milieu (êta) et son rayon (r). La mobilité est une caractéristique de chaque
particule, il est donc possible d’effectuer une séparation en se basant sur cette propriété.
D.1. Électrophorèse sur gel d’agarose :
L’électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie
moléculaire : • Soit à des fins analytiques : pour séparer et identifier des fragments d'ADN, pour
déterminer leur taille, pour en estimer la quantité, • Soit à des fins préparatoires, pour purifier
un fragment d'ADN de taille connue. La taille des fragments qu'il est possible de séparer est
comprise entre 0,2 et 50 kb. Les fragments d'ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à
un colorant fluorescent, le bromure d'éthidium (BEI). On peut ainsi visualiser en lumière UV
des quantités très faibles d'ADN (de l'ordre de 5-10 ng).
D.2. Sur gel de polyacrylamide
D.2.1. L’électrophorèse en conditions non dénaturantes Cette technique aussi appelé PAGE
(pour Polyacrylamide Gel Electrophoresis) est très utilisée en immunologie, dans l'étude des
protéines et également utilisée pour le séquençage de l'ADN. Le gel de polyacrylamide est
constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui
est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2
substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
Les protéines migreront vers l’anode (+) selon leur ratio charge/masse
D.2.2. L’électrophorèse en conditions dénaturantes
Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui est un
détergent anionique fort. Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se fixant sur les
protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en
fonction de leur masse moléculaire. Les protéines sont dites dénaturées : elles ont perdu leur
structure tridimensionnelle native. Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du
SDS, on utilise un agent réducteur, le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des
protéines les rendant ainsi sous forme monomérique. La forte charge négative globale apportée
par le SDS masque la charge intrinsèque des protéines.
D.3.Visualisation des protéines dans les gels
Une fois que la migration des protéines dans le gel est terminée, il faut visualiser les bandes
obtenues par les protéines - les différentes approches sont :
• la coloration avec le bleu de Coomassie brillant

• la coloration au nitrate d’argent.
• Le bleu noir naphtol.
- une approche plus spécifique consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un Exemple de gel
après coloration au bleu de Coomassie.
E.1.Electrophorèse bidimensionnelle
Lorsqu'il est existé des bandes protéiques très proches, on a un chevauchement. Par les
méthodes unidimensionnelles la résolution et bon pour moins de 50 protéines. Grâce à
l'électrophorèse bidimensionnelle, on combine deux modes de séparation différents. La
résolution peut être appliquée pour plus de 1000 protéines différentes.
• DIMENSION 1
Séparation des protéines en fonction de la charge par Focalisation Isoélectrique (FIE). La

migration est effectuée dans un gradient de pH, chaque molécule migre jusqu'à l’endroit où le
pH est égal à son phi. On utilise un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose), pour que
la taille n’influence pas la migration. Le gradient de pH est généré par des ampholytes,
molécules amphotères de synthèse introduites dans le gel au momoent de sa fabrication : on
utilise un mélange de telles molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme
large ex :3-9, ou plus ou moins étroite ex : 4-5 ou 5-6.5) On réalise une électrophorèse dans un
tube étroit de gel polyacrylamide où un gradient de pH est établi. On soumet alors à un fort
courant électrique
Les protéines migrent vers la position du gradient = pHi et s’y immobilisent.

• DIMENSION 2
Séparation en fonction de la taille des protéines : SDS-PAGE Le gel étroit de protéines séparées
par FIE est soumis à une SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire.
Techniques
immunologiques et
immunoélectrophorèse
I – Mesure et utilisation des anticorps
A – Mesure du titre d’un anticorps.
A – 1 – Définitions
La présence d’un anticorps spécifique peut être mesurée par plusieurs méthodes
différentes. Certaines d’entre elles mesurent la fixation directe de l’anticorps (Ac) sur l’antigène
(Ag). Ces techniques sont basées sur des interactions primaires alors que d’autres détectent les
changements physiques de l’antigène induit après la fixation de l’antigène et sont donc basées
sur des interactions secondaires. Quoi qu’il en soit, ces deux types de tests peuvent être
employés pour mesurer le titre et la spécificité des anticorps produits au cours de la réponse
immunitaire. Ces tests ayant été utilisés historiquement pour détecter la présence d’anticorps
dans le sérum de patients, on les appelle communément tests sérologiques. La quantité
d’anticorps présente dans le sérum est déterminée par titrage de celui-ci en dilution limite. Le
titre d’un sérum correspond à l’inverse de la dernière dilution positive. Il est à noter que certains
auteurs définissent le titre d’un sérum comme la dilution donnant 50% de la réaction maximale
observée. Ainsi chaque laboratoire devra fournir pour le test la définition utilisée pour calculer
le titre du sérum.
Figure 1 : Mesure du titre d’un anticorps
A – 2 – Méthodes directes de dosage des anticorps
Deux méthodes sont couramment utilisées pour mesurer la fixation directe des anticorps sur un
antigène : Le RIA (RadioImmuno Assay), l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
et les techniques d’inhibition compétitives
A – 2 – 1 – RIA (RadioImmuno Assay)
L’antigène spécifique des anticorps que l’on veut détecter est préalablement marqué à
l’iode 125. La préparation contenant l’anticorps est alors incubée avec l’antigène marqué. Les
complexes Ag/Ac qui se forment en phase liquide sont alors précipités avec une solution de
chlorure d’ammonium ou de polyethylèneglycol. Le culot de précipitation est ensuite lavé avec
une solution saline et la présence de l’anticorps à doser est déterminée en mesurant la
radioactivité présente dans le précipité et en la comparant avec une gamme étalon réalisée soit
avec un sérum titré soit avec une préparation purifiée d’anticorps de concentration connue.
Cette technique bien que relativement coûteuse et délicate car utilisant des produits radioactifs,
présente l’avantage d’une grande sensibilité. En biologie clinique, cette méthode est encore
employée pour détecter la présence d’anticorps anti-ADN natif chez les patients atteints de LED
(test de Farr) ou pour la détection des anticorps anti-GAD chez les diabétiques.
Figure 2 : Technique de RIA
A – 2 – 2 – l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
La technique ELISA, plus simple et moins coûteuse a presque totalement remplacé le

RIA. La révélation du test n’utilise pas, comme dans le RIA de radioéléments mais est liée au
clivage par une enzyme, d’un substrat incolore en un produit coloré. Pour détecter la présence
dans un sérum d’un anticorps spécifique, l’antigène spécifique de l’anticorps à doser est déposé
dans un puits à fond plat en plastique. L’antigène est dilué dans un tampon bicarbonate à pH
9,6 ce qui favorise les interactions électrostatiques entre l’antigène et le plastique de la plaque
et permet la fixation stable de l’antigène au fond du puits. Des dilutions limites du sérum
contenant l’anticorps à doser sont alors déposées dans les puits. Après un temps de contact
suffisant, les puits sont lavés avec une solution saline de sorte que seuls les anticorps spécifiques
restent fixés sur l’antigène et donc au plastique. on révèle la présence de l’anticorps fixé au fond
de la plaque en déposant ensuite dans le puit un anticorps anti-Immunoglobuline marquée avec
une enzyme qui peut être la phosphatase alcaline ou la peroxydase. Après lavage, il ne reste
plus qu’à révéler la présence des anticorps spécifiques en ajoutant le substrat de l’enzyme ayant
servie à marquer les anticorps anti-Immunoglobuline et à lire la réaction colorée.
Figure 3 : Principes de l’ELISA
A. Dosage ELISA direct
Dans un dosage ELISA direct, l’antigène est lié au fond du puits de la microplaque, puis il est
lié par un anticorps qui lui est spécifique et également conjugué à une enzyme ou à une autre
molécule qui permet la détection.
B. ELISA indirect
Dans un test ELISA indirect, l’antigène est lié au fond du puits de la microplaque, puis un
anticorps spécifique à l’antigène est ajouté. Un anticorps secondaire, conjugué à une enzyme
ou à une autre molécule de détection est ensuite lié au premier anticorps.
C.ELISA compétitif
Dans un ELISA compétitif, un antigène de référence est lié au fond des puits de la microplaque.
L’échantillon plus l'anticorps sont ajoutés aux puits, et si un antigène est présent dans
l’échantillon, il est en compétition avec l’antigène de référence pour se lier à l’anticorps. La
substance non liée est éliminée. Plus la quantité d’antigène est importante dans l’échantillon,
plus la quantité d’anticorps liée par l’antigène de référence au fond des puits est faible, et plus
le signal est faible.
D.Dosage ELISA de type sandwich
Pour le dosage ELISA de type sandwich, deux anticorps spécifiques à deux épitopes différents
sur l’antigène cible sont utilisés. L’anticorps de capture est lié au fond du puits de la
microplaque et se fixe à un épitope de l’antigène. L’anticorps de détection se lie à l’antigène à
un épitope différent et est conjugué à une enzyme qui permet la détection. (Si l’anticorps de
détection n’est pas conjugué, alors un anticorps de détection conjugué à une enzyme secondaire
est requis).

Techniques de Laboratoire 01

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TECHNIQUES DE

Figure 1. Les champs d’utilisation des microscopes

1.La microscopie électronique

Les types Utilisation permet :

Le microscope électronique a transmission La transmission de l’image par des faisceaux

Le microscope électronique à balayage (MEB) La formation de l’image de l’ultrastructure

1.2. Microscope électronique à transmission

1.2.1. Principe du fonctionnement

- L2 et L3 jouent le rôle d’objectif et permettent l’agrandissement de l’objet.

Figure 1 : Principe de fonctionnement du microscope optique et électronique à transmission

1.2.2. Caractéristiques des électrons

Les avantages majeurs du rayonnement électronique sont

- De plus, ces particules interagissent fortement avec la matière.

1.2.3. Les composants de MET

Figure 2 : Le canon à électrons

Figure 3 : Lentilles électromagnétiques

1.2.4. Préparation des coupes cellulaires ultrafines

Figure 4. Résumé de la méthode de préparation des coupes.

2. Le Microscope Electronique à Balayage (MEB)

- Des détecteurs d’électrons.

-Un système de visualisation d’image couplé de manière synchrone au même générateur de

2.1. Préparation des échantillons

2.2. Etapes de la technique

o Préparation de la solution constituée de l’échantillon et de l’acide

2.3. Diffusion des électrons

Il existe deux cas

o Un électron primaire du faisceau incident entre en collision avec l'échantillon.

La technique de spectrophotométrie est basée sur la propriété de la matière, et plus

est le coefficient d'atténuation molaire ou d'absorptivité propre à l'entité chimique

• Proche-UV : 200 nm -400 nm.

• UV-lointain : 10 nm- 200 nm.

Le spectrophotomètre UV-visible est constitué des éléments suivants :

➢ Source de lumière monochromatique :

Visible : Lampe à incandescence à Tungstène et iode.

UV : Lampe à arc à Deutérium ou à Xénon, ou mercure.

➢ Monochromateur (sélection de la longueur d’onde)

➢ Détecteur = Photomultiplicateur ou photopiles

Les différentes configurations des spectromètres UV/VIS :

➢ Spectromètres à optique monofaisceau, de type monocanal.

La spectroscopie UV-Visible se réalise à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la cuve

Schéma de principe de lecture d'un échantillon en spectroscopie UV-visible

5. Allure du spectre d’absorption UV-visible : A = f (λ)

• Spectre UV-visible : tracé de l’absorbance en fonction de la longueur d’onde (usuellement

6.APPLICATIONS DE LA SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE

Les spectres UV fournissent généralement peu de renseignements sur la structure moléculaire

Comme applications, on peut citer :

• Dosage du fer dans l’eau ou dans un médicament.

• Dosage des molécules actives dans une préparation pharmaceutique.

La centrifugation permet de séparer des constituants de taille et de masse très différentes

La gravité : C’est la force qui s’exerce du haut vers le bas.

La poussée d’Archimède : C’est la force qui s’exerce du bas vers le haut.

Il existe deux principaux types :

2.1. L’ultracentrifugation différentielle

On l'appelle ultracentrifugation différentielle car basée sur la différence de vitesse de

Le principe de ce type de centrifugation est de séparer les différents constituants à l’aide de

Figure 7. Différentes étapes de l’ultracentrifugation différentielle

2.2. L’ultracentrifugation en gradient de densité

On a vu précédemment que la vitesse de sédimentation est fonction de la différence (dp - dm),

Il existe deux types de gradients :

A) Les gradients discontinus

Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un

A partir de ce principe général, il existe plusieurs variantes de cette technique adaptées à

L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines, peptides, acides