Cours Méthodes immunologiques et sérologiques (MI BPC)

Enseignant : Lamraoui R

Sommaire

I. Propriétés de la réaction antigène-anticorps ....................................................................................2

I.1. Bases moléculaires de la liaison antigène-anticorps ..................................................................2

I.2. Spécificité de la réaction ..............................................................................................................3

I.3. Affinité de l’anticorps...................................................................................................................3

I.4. Avidité de l’anticorps ...................................................................................................................3

I.5. Réversibilité de la réaction ..........................................................................................................4

II. Facteurs modulant la taille des complexes immuns ........................................................................4

II.1. Concentrations respectives en antigène et en anticorps ..........................................................4

II.1.1. Principe de la zone d'équivalence .......................................................................................4

III. Réaction de précipitation en milieu gélifié .....................................................................................5

III.1. Principe.......................................................................................................................................5

III.2. Applications de la réaction de précipitation ...........................................................................5

III.2.1. Méthodes de précipitation en gel ......................................................................................5

III.2.2. Méthodes qualitatives.........................................................................................................6

III.2.2.1 Immunodiffusion double d’Ouchterlony..................................................................6

III.2.2.2 Immunoélectrophorèse ..............................................................................................6

III.2.3. Méthodes quantitatives ......................................................................................................7

III.2.3.1 Immunodiffusion radiale de Mancini .......................................................................7

Année universitaire 2019/2020

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I.Propriétés de la réaction antigène-anticorps

L'antigène et l'anticorps interagissent entre eux selon un phénomène réversible caractérisé par
l’établissement de nombreuses liaisons non covalentes aboutissant à la formation du complexe antigène-
anticorps (ou complexe immun).

I.1.Bases moléculaires de la liaison antigène-anticorps

Les bases moléculaires de la réaction reposent sur la complémentarité, la spécificité et la réversibilité

de la liaison entre un anticorps et un antigène. Cette interaction physique résulte de la reconnaissance d'un
épitope (déterminant spécifique de l'antigène) par le paratope (site porteur de la spécificité de l'anticorps)
et de la mise en place de forces attractives et répulsives dont la résultante conduit à l’établissement d’une
liaison non covalente entre l’antigène et l’anticorps.

Quatre types de forces sont impliqués

Les liaisons électrostatiques sont des forces d'attraction ou de répulsion qui résultent respectivement
de l’établissement de liaisons ioniques entre des atomes ou groupes d'atomes dont les charges électriques
sont opposées ou de même signe (groupe COOet NH3 + dans le cas des protéines) ;

Les liaisons hydrogène correspondent à des liaisons électrostatiques établies entre un atome
d’hydrogène (électropositif) d'une molécule et un atome électronégatif (oxygène ou azote), d'une autre
molécule ;

Les liaisons hydrophobes correspondent aux forces qui d’établissent entre des molécules non polaires
ou des parties non polaires de molécules, c'est-à-dire ne contenant pas de groupements chargés, et
favorisent leur agrégation en milieu aqueux. Les molécules d’eau ne peuvent établir de liaisons hydrogène
avec des groupements non polaires. Ainsi, lorsque de tels groupements entrent en contact étroit, lors de
l’association antigène-anticorps par exemple, les molécules d’eau engagées dans ces zones sont attirées
vers l’extérieur par les liaisons hydrogène qui les unissent aux autres molécules d’eau et ont ainsi
tendance à former de véritables « filets » autour de ces groupements non polaires. D’une certaine
manière, la force qui en résulte amène les molécules d’eau réunies entre elles à exercer une pression sur
les groupements non polaires qui conduit à une augmentation de la stabilité de liaison qui s’établie entre
eux. Ainsi les liaisons hydrophobes qui s’établissent entre deux groupements non polaires sont le reflet de
la force qui unit les molécules d’eau à leur voisinage. Les acides aminés aromatiques en sont des
exemples.

Les forces de Van der Waals sont dues aux mouvements des électrons de deux molécules. Il s'agit de
la force d'interaction entre les différents nuages électroniques. Ces forces, assez faibles, jouent seulement
un rôle en cas de complémentarité étroite entre l’antigène et l’anticorps, mais sont alors très efficaces.

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 I.2.Spécificité de la réaction

Le site de liaison de l'anticorps (Fab) est spécifique d'un déterminant antigénique donné. Cette
spécificité est un élément essentiel de la réaction Ag-Ac. Elle repose sur une complémentarité physique
étroite entre paratope et épitope. Un antigène est le plus souvent une molécule complexe, porteuse de
plusieurs épitopes. Chacun d’entre eux peut être reconnu par un anticorps qui lui est spécifique. Le sérum
d'un animal immunisé par un antigène complexe contient un mélange d'anticorps de spécificités
épitopiques différentes. Utilisés comme réactifs, ils constituent des anticorps polyclonaux, issus de
plusieurs clones différents de lymphocytes B producteurs d'anticorps. Ces anticorps sont capables de
reconnaître plusieurs épitopes, présents sur l'antigène immunisant, mais dont certains peuvent être
présents à la surface de molécules différentes. Chacun des anticorps constitutifs du mélange est porteur
d'une spécificité donnée, et ne peut reconnaître qu'un unique épitope, une séquence particulière, ou une
séquence très proche. La capacité que possède un anticorps de reconnaître deux Ag non strictement
identiques s'explique par une communauté antigénique partielle : on parle alors de réaction croisée.

I.3.Affinité de l’anticorps

L'affinité caractérise la force et la stabilité de la liaison entre l'Ag et l'Ac. Elle est élevée lorsqu'une
complémentarité stérique étroite existe entre le paratope et l’épitope permettant aux forces d'attraction de
s'exercer pleinement. La liaison antigène-anticorps est une liaison dynamique. L’affinité de la liaison Ac-
Ag varie en fonction de la nature des groupes qui interagissent, de la température, du pH et de la force
ionique. L'affinité intrinsèque d'un Ac vis-à-vis d'un Ag est définie par la constante d'association. Cette
constante Ka = [Ag-Ac] / [Ag].[Ac] est évaluée par la mise en présence d’un anticorps avec un antigène
monovalent à un pH proche de la neutralité et à des concentrations physiologiques en sels. Pour des
anticorps très affins, cette constante est de l'ordre de 1010 à 1013 L/mol, pour des anticorps peu affins, de
l'ordre de 10 7 à 1010 L/mol. A titre comparatif, la constante d’association varie de 104 à 106 L/mol pour
la plupart des interactions enzyme-substrat.

I.4.Avidité de l’anticorps

L'avidité correspond à la force avec laquelle un anticorps multivalent se lie à un antigène multivalent.
Même si l'avidité d'un anticorps pour l'antigène conditionne la rapidité avec laquelle s’établie la liaison
Ag-Ac, cette réaction dépendra d'abord de l'affinité de chacun des sites anticorps pour les différents
déterminants antigéniques. L'avidité est donc la résultante de l'affinité intrinsèque des réactions
moléculaires, entre les épitopes et les paratopes, et du nombre de valences de l'anticorps et de l'antigène.
Au niveau moléculaire simple, l'affinité concerne une seule relation épitope-paratope dans un contexte
expérimental, alors que l'avidité tient compte des nombreuses relations épitopeparatope dans un contexte
physiopathologique.

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 I.5.Réversibilité de la réaction

Au cours de l’établissement de la liaison Ag-Ac, il n'y a ni destruction de l'anticorps, ni de l'antigène,

par opposition aux liaisons enzyme-substrat où le substrat est métabolisé. La réaction est donc une
réaction équilibrée et réversible. De plus, les conditions physicochimiques (chaleur, acidification du
milieu ou apport d'ions, etc.) influent sur cette réaction. La réversibilité des liaisons établies rend possible
la dissociation ultérieures des complexes Ag-Ac préalablement formés (phénomène d'élution) et permet
notamment la séparation et la purification en laboratoire de l'antigène ou de l'anticorps.

II.Facteurs modulant la taille des complexes immuns

II.1.Concentrations respectives en antigène et en anticorps

II.1.1.Principe de la zone d'équivalence

Les trois zones présentées sur la Figure 1 correspondent aux trois états physiques induits par la
formation de la liaison Ag-Ac. Si on ajoute des quantités croissantes d'Ag solubles à une solution d'Ac de
concentration fixe, chaque antigène sera recouvert dans un premier temps de plusieurs anticorps (zone où
l’Ac est en excès), par la suite un réseau d’une taille croissante se forme progressivement jusqu’à
atteindre un rapport Ag/Ac optimal (zone d'équivalence) qui permet d'observer la précipitation maximale
du réseau. Les anticorps et antigènes ne sont alors plus présents sous forme libre mais complexée. Au-de
là de ce rapport Ag/Ac optimal, l’addition supplémentaire d’antigènes entraîne la dissociation partielle du
réseau, permise par le caractère réversible de la liaison Ac-Ag, et la quantité de précipités formés diminue
(zone où l’Ag est en excès). Ceci s'explique par le déplacement de la liaison Ag-Ac grâce à l’excès d'Ag.
En effet, la concentration de l’Ag est alors largement supérieure à celle de l'Ac avec de nombreux sites
antigéniques qui restent libres d'où une rupture du réseau. Ces trois zones existent toujours pour un couple
Ag-Ac donné.

L'apparition d'un précipité s'explique par la formation d'un réseau tridimensionnel qui ne peut exister
qu'en présence d'Ag à épitopes multiples et d'Ac multivalents. Les complexes immuns ainsi formés sont
des édifices multimoléculaires dont la solubilité diminue avec la taille jusqu'à la précipitation. Plus
précisément, la réaction de précipitation comprend deux phases : la première, rapide, se caractérise par la
formation de complexes immuns solubles et conduit à la formation du réseau, la seconde, plus lente,
constitue la précipitation proprement dite, rendue possible par l’établissement de ponts ioniques entre les
groupes de charges différentes portés par les molécules d’anticorps devenues voisines et dont
l’association est alors plus étroite et stable.

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 Figure 1: Quantité de précipités formés en fonction du rapport de concentration entre l’antigène et l’anticorps

III.Réaction de précipitation en milieu gélifié

La réaction de précipitation se produit lorsque des complexes immuns insolubles se forment en

abondance. Elle permet de détecter un antigène, un anticorps, ou d’analyser un mélange d’antigènes.
L’utilisation d’un milieu gélifié permet de produire des gradients réguliers de concentration d’antigène et
d’anticorps, afin de créer les conditions optimales de la précipitation. La diffusion peut être accélérée par
électrophorèse. Les complexes immuns sont emprisonnés dans les mailles du gel et ne peuvent plus
migrer, ils forment des arcs de précipitation. L’agarose est le milieu le plus utilisé. On distingue les
méthodes d’analyse qualitatives (immunodiffusion double d’Ouchterlony, immunoélectrophorèse) et les
méthodes quantitatives (immunodiffusion radiale de Mancini).

III.1.Principe

C’est la formation de complexes immuns insolubles spontanément visibles permettant de détecter un

antigène, un anticorps, ou d’analyser un mélange d’antigènes. Les complexes immuns sont longs à
apparaître dans un milieu gélifié, on peut accélérer la rencontre de l’antigène avec l’anticorps en les
soumettant à un champ électrique. Ce sont des méthodes dont la sensibilité est de l’ordre du milligramme
d’antigène par litre. Cette faible sensibilité limite leur emploi aux dosages de protéines sériques ayant une
forte concentration.

III.2.Applications de la réaction de précipitation

III.2.1.Méthodes de précipitation en gel

L’intérêt d’un milieu gélifié est de permettre l’instauration de gradients réguliers de concentration
d’antigène et d’anticorps, afin de créer les conditions optimales de la précipitation. Les complexes
immuns sont emprisonnés dans les mailles du gel et ne peuvent plus migrer, ils forment des arcs de

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précipitation. L’agarose est le milieu le plus utilisé. Ses interactions avec les protéines et les courants
d’électroendosmose sont négligeables.

III.2.2.Méthodes qualitatives

III.2.2.1 Immunodiffusion double d’Ouchterlony

Dans des boîtes de Pétri recouvertes d’un gel d’agarose à 1 % (la concentration dépend de la qualité de
l’agarose), des puits sont creusés avec un emporte-pièce. L’antigène et l’anticorps sont déposés dans les
puits. Dans la zone de rencontre de l’antigène avec l’anticorps, il se forme un arc de précipité au bout de
24 à 48 heures, visible avec un éclairage à fond noir ou en colorant les protéines (figure de la séance du
cours).

La distance du précipité au puits est fonction de plusieurs paramètres :

– le carré de la distance du précipité au puits est proportionnel à la concentration du réactif, l’antigène

ou l’anticorps. Si un arc est collé au puits, il faudra diluer moins ce réactif ;

– les grosses molécules diffusent moins vite, et l’arc sera proche du puits. Dans un mélange
antigénique complexe, cette méthode permet :

1. de dénombrer le nombre d’antigènes. Chaque arc correspond à au moins un antigène ;

2. de comparer des antigènes déposés dans des puits contigus. Si les deux antigènes sont
identiques on obtient une réaction d’identité, les deux arcs se rejoignent et sont en continuité.
S’ils sont différents, les deux arcs se croisent, il y a non-identité. Si les deux antigènes ont en
commun certains épitopes, et que l’un des antigènes a des épitopes supplémentaires, on observe
une réaction d’identité partielle, un des arcs croise l’autre, formant un éperon unique. C’est un
système symétrique, on peut comparer aussi des anticorps. Très utilisé dans l’exploration des
maladies auto-immunes, pour la détection des anticorps anti-antigènes nucléaires solubles, il
permet une identification par rapport à un anticorps de référence.

III.2.2.2 Immunoélectrophorèse

Décrite par Grabar et Williams, elle permet une analyse fine d’un mélange d’antigènes. De l’agarose à
1 % chauffée à 100 C◦ est coulée sur une lame de verre. Après refroidissement, des puits et des gouttières
de 1mm de large perpendiculaires à l’axe des puits sont creusés à l’aide d’un emporte-pièce. Les sources
d’antigènes sont déposées dans les puits et soumises à un champ électrique, 5 à 8 V/cm de gel, en tampon
véronal 0,075 M à pH 8,6. Les antisérums sont déposés dans les gouttières, et après incubation de12 à
24heures, les arcs de précipitation sont lus.

Avec le sérum humain comme source d’antigène on observe une trentaine d’arcs. L’intérêt de cette
méthode réside dans la détection d’une immunoglobuline monoclonale. Les immunoglobulines présentent

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globalement une migration cathodique, l’arc des immunoglobulines (Ig) G étant le plus long et le plus
cathodique, l’IgA est plus court et l’IgM se détache à peine du puits. La distance de l’arc à la gouttière est
proportionnelle à la concentration de la protéine, et inversement proportionnelle à sa masse moléculaire.
La longueur de l’arc est fonction de la clonalité. Un arc court traduit une oligoclonalité. La présence
d’une immunoglobuline (Ig) monoclonale se traduit par une bosse au niveau de l’arc. Dans le myélome
multiple, les Ig normales sont diminuées et la protéine monoclonale est prédominante. Une IgM
monoclonale est souvent mal visualisée à cause de sa faible migration. De plus, il est impossible de
déterminer sa chaîne légère, et cela vaut aussi quelque fois pour les IgA, à cause des IgG quantitativement
plus importantes qui constituent une barrière qui neutralise les anticorps anti-chaînes légères.

III.2.3.Méthodes quantitatives

Elles permettent de doser un antigène dans un milieu biologique complexe.

III.2.3.1 Immunodiffusion radiale de Mancini

L’anticorps est inclus dans le gel encore chaud et coulé sur une boîte de Pétri. Dans des puits creusés
dans l’agarose, on dépose des quantités connues de l’antigène, ainsi que l’antigène à doser. Il se forme un
précipité concentrique autour des puits, dont la surface (ou le carré du diamètre) est proportionnelle à la
concentration de l’antigène (figure de la séance du cours). Cette technique ne nécessite que très peu
d’appareillage, une loupe. Des gels avec l’anticorps inclus sont vendus prêts à l’emploi. De nombreuses
protéines sériques sont dosées par cette méthode. Elle présente l’inconvénient de devoir attendre au moins
18 heures pour que le précipité se forme, de plus la précision de la méthode est faible.