Université des Frères Mentouri Constantine.

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de biologie et écologie végétale

Atelier de méthodologie de biologie moléculaire

Extraction et séparation des protéines totales du blé dur (Triticum durum)

par électrophorèse SDS – PAGE

3ème licence Biotechnologie et Génomique Végétale

Dr KACEM Nadia Sandra

Introduction
Les protéines sont des molécules qui ont un rôle dans la structure et la fonction de la cellule,
on peut les isoler, les analyser et les étudier. La séparation des protéines totales est réalisée
par électrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE. Cette technique analytique est basée sur
la migration différentielle de molécules ionisées soumises à un champ électrique continu, dans
un milieu électrolytique tamponné, de PH et de force ionique précise.

Objectifs des travaux pratiques

L’objectif de la séance est l’extraction et la caractérisation des protéines totale contenu dans
les grains du blé dur.

Principe de la technique SDS-PAGE

Toutes les techniques d’électrophorèse sont basées sur le principe de la mobilité séquentielle
des molécules protéiques dans un support soumis à un courant électrique. Cette mobilité est
fonction de :
 La charge électrostatique fournie par les cinq acides aminés acides ou basiques ;
 La dimension et la forme des protéines ;
 L’intensité du champ électrique (tension aux électrodes et conductibilité de support)
 La taille des mailles du support ;
 La température de l’électrolyte.

La technique d’électrophorèse utilisée est celle proposée par Laemli (1970) modifiée par
Payne et al., (1979) et Singh et al., (1991). La séparation se fait sur gel vertical en système
discontinu, en présence d’un détergent ionisé, le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).
En effet le β-mercaptoéthanol (2-mercaptoéthanol= BME), ou le DDT, dénature les
protéines en rompant les ponts disulfures, et le SDS détruisant les liaisons faibles. Ceci
aboutit à la formation d’un complexe SDS-protéines dénaturé avec une charge négative qui
masque la charge nette intrinsèque des protéines et annule ainsi la différence de migration dûe
à la charge électrique. Il permet donc une séparation selon la taille, la conformation et la
masse moléculaire.
La vitesse de migration des protéines dépend surtout de la taille des mailles du gel et de
la température de l’électrolyte.
MODE OPERATOIRE
1-Extraction des protéines totales
- le matériel de départ est un demi-grain de chaque génotype, broyé dans un mortier en
une poudre fine, à l'aide d'un pilon. Le broyat est mis dans un tube Eppendorf.
- Transfer le broyat dans un tube Eppendorf de 1.5 ml.
- Ajouter 1ml de solution A de précipitation (Annexe 1) et homogénéiser dans le
tube Eppendorf de 1.5 ml
- Laisser reposer pendant 1h à -20°C.
- Centrifuger à 13 000 rpm pendant 15 min à 4°C
- Eliminer le surnageant délicatement en renversant le tube (le culot ne doit pas
décoller).
- Laver les culots avec 1ml de la solution de rinçage solution B (Annexe 1).
- Laisser reposer 1h à -20°C puis éliminer le surnageant délicatement.
- Sécher les culots dans l’étuve pendant 2 à 3 min à 60°C.
- Reprendre la poudre du culot (à l’aide d’un piston propre ou baguette en verre) dans
un volume de 100µl du tampon de solubilisation de Laemmli buffer (Annexe 1)
- Passer les tubes Eppendorf au vortex 5 à 10 secondes
- Incubation au bain-marie 5min à 100°C
- Centrifuger 10 min à 10 000 rpm pendant à 20C°, (stocker à -20°C).

2-Préparation des gels

La séparation des protéines par la technique SDS-PAGE nécessite la préparation de
deux types de gels (tableau ci-dessous).

- Les cassettes sont nettoyées à l'éthanol et placées l'une contre l'autre, tout en les
séparant par deux éspaceurs de largeur choisie, puis elles sont montées
- A l'aide d'une seringue, on coule le gel de séparation doucement entre les cassettes
afin d'éviter la formation de bulles
- On applique une couche de butanol afin d'égaliser sa surface
- Le gel de concentration est coulé au dessus du gel de séparation, on pose les peignes
(nettoyés auparavant a l'éthanol) délicatement
 Tableau : Composants du gel de séparation et de concentration
Produits [C] finale Gel Gel de
de séparation 12% concentration
4%
Acry Bis 40% 40% 1.8ml 0.2ml

1.5M Tris HCL ph 0.375 M 1.5ml /

8.8
0.5M Tris HCL ph 0.125 M / 0.5ml
6.8
10% SDS 0.1% 60µl 20µl

10% APS 0.05% 30µl 10µl

TEMED 0.1% 6µl 2µl

H2O distillée / 2.6ml 1.27ml

Total / 6ml 2ml

3-Remplissage de la cuve
-Remplir le compartiment intérieur (entre les deux plaques) puis le compartiment principal de
la cuve avec le tampon de migration pH8.8 (Annexe 2), jusqu’à atteindre environ 5 cm en
dessous de la limite de remplissage.
4-Chargement du gel
-Déposer 30 à 40µl d’échantillons dans les puits à l’aide de microseringue. Un puits est
réservé pour des standards le marqueur moléculaire connu (Annexe 2). Après chaque dépôt
rincer la micro-seringue avec le tampon de migration.

5-Mise en route de l’électrophorèse

-Après réalisation des dépôts, fermer la cuve à électrophorèse avec le couvercle porte-
électrodes. S’assurer du bon verrouillage du couvercle.
-Raccorder les électrodes au générateur, puis mettre en service. Choisir le mode manuel sur le
générateur et régler les conditions de migrations (80 mA, durée 2 à3h).
- quelques instants après le lancement, vérifier que de la buée apparaît sur le couvercle, ainsi
que l’apparition de fines bulles dans la cuve traduit le bon fonctionnement du champ
électrique.
- régulièrement en cours de migration, vérifier visuellement le bon déplacement des bandes au
sein du gel.

6-Récupération du gel
-Après la fin de la migration, ouvrir le couvercle, sortir le bloc support + gel d’électrophorèse.
Eliminer le tampon présent dans le compartiment interne dans un récipient à déchets.
Le tampon présent dans la cuve principale doit être récupéré.
-Démonter les différentes fixations pour récupérer la cassette de gel.
-Pour récupérer le gel, il faut séparer les deux plaques plastiques au sein desquelles il a été
coulé. On utilisera une spatule inox pour faire levier entre les deux plaques.

Attention : le gel est très fragile. Dès que les deux parties plastiques ont été séparées,
plonger la face en plastique sur laquelle le gel est encore collé dans un bain d’eau
distillée. Achever la séparation du gel sous l’eau, progressivement par mouvements
d’oscillations.

6- Coloration et décoloration du gel

Dès la sortie du front de migration, on arrête la migration, les gels sont démoulés
soigneusement et placés dans un bac en plastique et couverts de solution de coloration On
prépare une solution de coloration qui contient un fixateur de protéines le TCA (acide
trichloroacetique) du bleu de coomassie R250 et de l'eau distillée (Annexe 2).

Ce bac est placé en agitation pendant 24 à 48h puis les gel sont décolorés dans une solution
de décoloration et là il est prêt à la lecture.

Après lavage les protéines apparaissant comme des bandes sur un fond transparent. On
peut alors déterminer le nombre des bandes qui présentent différents protéines, ainsi que leur
masse (grâce au marqueur de taille).
ANNEXE 1 : SOLUTIONS DE L’EXTRACTION DES PROTEINES TOTALES

- Solution A : solution de précipitation

TCA (100%) 10ml (10g TCA/100ml acetone) 10%

Β-mercaptoéthanol 70µl 0.07%
Acetone qsp 100ml
(Toujours placer au froid)

- Solution B: solution de Rinçage

Β-mercaptoéthanol 70µl 0.07%

Acétone qsp 100ml
(toujours placer au froid)

- Laemmli (tampon de dénaturation)

Tris-HCL6.8 (1M) 6.25ml
SDS 10% 10ml
Glycérol 5ml
Β-mércaptoéthamol 1ml
Bleu de bromophénol 0.005g
Eau qsp 50ml
 ANNEXE 2 : SOLUTION ET TAMPON UTILISES POUR SDS-PAGE

Solution mère d'acrylamide à 40% ( à préparer avec gants et masque)

Acrylamide 40g
Eau distillée qsp 100 ml

Solution mère de bis acrylamide à 2% ( préparer avec gants et masque)

Bis acrylamide 2g
Eau distillée qsp 100 ml

Solution stock de SDS à 10%

Sodium Dodécyl Sulfate 10 g
Eau distillée qsp 100 ml

Solution d'APS (Ammonium Persulfate) à 1%: préparer extemporanément

APS 0.1 g
Eau distillée qsp 10 ml

Tampon Tris-HCL ph 8.8 (à préparer sous la hotte, avec gants et masque)

Tris (hydroxyméthyl minomethan) 60.57 g
Ajuster à ph 8.8 avec du HCL fumant 8 à 10mlEau distillée qsp 500 ml

Tampon Tris HCL ph 6.8 ( à préparer sous la hotte, avec gants et masque)
Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 30.28 g
Ajuster à ph 6.8 avec du HCL fumant 19.5 ml Eau distillée qsp 250 ml

Tampon d'électrophorèse
Glycine 70.55 g
Tris (hydroxyméthyl amino Ethan) 15 g
SDS 5g
Eau distillée qsp 5000 ml
Solution de coloration (pour deux gels)
TCA 60% 100 ml (60g TCA/100ml Eau distillée)
Solution mère de bleu de Coomassie R-250 25ml
Eau distillée qsp 500ml

Solution mère de bleu de Coomassie R-250

Bleu de Coomassie R-250 10g
Ethanol 95°qsp 1000ml

L'Ethanol doit être mis en agitation dans l'éprouvette, avec un barreau armenté. Le
bleu de Coomassie est ensuite ajouté (sinon le bleu de Coomassie prend en masse).
Laisser en agitation au moins 2heure, puis filtrer la solution.

Tableau : Composition du marqueur de taille (low Molecular Weitht "LMW")

Protéine Poids moléculaire (kda)
Α -Lactalbumine 14.4
Inhibiteur de la trypsine 20.1
Carbonique anhydrase 30
Ovalbumine 45
Albumine sérique bovine 66
Phosphorylase b 97