Travaux Pratiques

Module de Génétique II
« SV5 »

Pr. A. SOUKRI
Pr. B. EL KHALFI

Année universitaire : 2020 - 2021

 Présentation

Le TP a pour but d’illustrer le phénomène de la recombinaison génétique Rec A dépendante

en utilisant un plasmide qui porte des répétitions directes en tandem et la transformation, par
ce dernier, des deux souches d’E.coli RecA+ et RecA-

Pour cela les étudiants seront amenés à effectuer les manipulations suivantes :

Repiquage des transformants sur milieu liquide LB + Ampicilline,

Extraction d’ADN plasmidique,

Electrophorèse sur gel d’agarose,

Analyse du gel et discussion des résultats.

Durée du TP : 2 demies journées par groupe

Note : Les étudiants doivent être munis de polycopie de TP, d’une blouse
blanche et des marqueurs permanents.
1
I- Obtention des transformants sur milieu liquide LB + Ampicilline

1- Préparation des bactéries compétentes :

Une préculture de bactéries E. coli (RecA+et RecA-) est obtenue en ensemençant environ 5 ml du
milieu de culture LB avec une colonie d’E. coli puis incubée une nuit à 37 ºC sous agitation.

 Ensemencer 50 ml du milieu LB avec 500 µl de la préculture puis incuber à 37ºC sous

agitation.
 Prélever 1,5ml de la culture, en phase exponentielle, et les mettre dans un tube eppendorf, puis
centrifuger à 12 000 tours/min pendant 3 à 5 min.
 Eliminer le surnageant et si nécessaire prélever à nouveau 1,5 ml et répéter le processus.
 Resuspendre le culot dans 750 µl de CaCl2 stérile et prérefrigéré.
 Laisser 15 min dans la glace puis centrifuger (3 à 5 min à 12 000 tours /min)
 Resuspendre le culot dans 150 µl du CaCl2 et garder le tube dans la glace pendant au moins
30 min. les cellules sont alors compétentes et peuvent être conservées 2 à 3 jours à 4 ºC.

2- Transformation des bactéries compétentes (Rec A+ et Rec A- ) par l’ADN

plasmidique :

 Prendre le tube eppendorf contenant 150µl de cellules compétentes et ajouter l’équivalent de

100 ng de l’ADN plasmidique.
 Mettre le tube eppendorf dans la glace pendant 45 min
 Placer par la suite le tube eppendorf dans un bain marie à 42ºC pendant 2 min avant de
remettre à nouveau dans la glace pendant 2 min
 Ajouter stérilement l’équivalent de 1 ml de LB
 Homogénéiser puis incuber à 37ºC pendant une heure
 Centrifuger et resuspendre le culot dans 200 µl de LB
 Etaler 100 µl dans une boite de LB + Ampicilline.
 Incuber une nuit à 37°C dans l’étuve.

3- Analyse et repiquage des transformants :

 Sortir les boites de l’étuve et compter les colonies obtenues.

 Déterminer le nombre de transformants obtenus pour les deux souches transformés de E. coli
(RecA+ et RecA-)
 à laide d’un cure-dent stérile piquer une colonie de chaque boite (boite RecA+ et boite RecA-)
et ensemencer chacune des colonies dans un tube contenant LB + Ampicilline, puis incuber une
nuit à 37 ºC.

2
3
II- Extraction de l’ADN plasmidique :

1- Méthode de la Lyse Alcaline :

 Prélever 1,5 ml de la culture dans un tube eppendorf

 Centrifuger 3 min à 12000 tours/min

 Reprendre le culot dans 100 µl de la solution I :

(Glucose 50 mM, Tris-HCl 25 mM, pH8, EDTA 10 mM, Lysozyme 5mg/ml).

 Mélanger par inversion et laisser 10 min à température ambiante

 Ajouter 200 µl de la solution II : (SDS 1%, NaOH 0,2 N)

 Mélanger par inversion et laisser 10 min dans la glace

 Ajouter 150 µl de la solution III : (Acétate de K 5M)

 Centrifuger 5 min à 12 000 tours/min, puis transvaser le surnageant dans un autre

tube

 Ajouter 450 µl du mélange phénol / chloroforme, Mélanger par inversion et laisser

reposer

 Transvaser la phase aqueuse dans un autre tube eppendorf.

 Ajouter 1 ml d’éthanol froid puis mettre à - 20ºC et laisser précipiter 2h à une nuit.

 Centrifuger 20 min à 12 000 tours/min à froid puis vider le surnageant et laisser

sécher le culot.

 Resuspendre le culot sec dans environ 20 µl d’eau (si nécessaire un traitement à la

Rnase peut être effectué).

L’ADN sera analysé par électrophorèse.

4
5
6
2- Méthode STET :
Solution STET (Pour 300ml)

30g Saccharose

15ml Tris 1M, pH8

30ml EDTA 0.5M, pH8

3ml Triton X-100

 Inoculer une colonie dans 3 ml de milieu LB + Ampicilline

 Incuber une nuit à 37°C sous agitation

 Récupérer 1.5 ml de chaque culture dans un tube eppendorf stérile

 Centrifuger 3 min à 13000 tours/min à température ambiante

 Eliminer le surnageant

 Si nécessaire, rajouter à nouveau 1.5ml de la culture re-centrifuger puis éliminer le

surnageant.

 Suspendre le culot dans 500µl de la solution STET

 Ajouter 5µl de lysozyme 5%. Mélanger par inversion

 Placer les tubes dans un flotteur et les laisser 2 min au bain marie à 100°C

 Centrifuger 15 min à 13000 tours/min et à température ambiante

 Eliminer le culot mucoïde à l’aide de cure dent stérile

 Ajouter au surnageant 10µl de NaCl à 5M et 0.4 ml d’Isopropanol

 Mélanger par inversion et congeler 15 min à -20°C

 Centrifuger 15 min à 13000 tours/min à froid et éliminer le surnageant

 Ajouter 1 ml d’éthanol 70% froid

 Centrifuger 15 min à froid à 13000 tours/ min et éliminer le surnageant

 Laisser sécher le culot d’ADN plasmidique

 Resuspendre dans 20 µl d’eau distillée stérile

L’ADN sera analysé par électrophorèse.

7
III- Electrophorèse sur gel d’agarose :

Préparation du gel :

Pour préparer un gel d’agarose 1%, peser 1g d’agarose dans un erlenmeyer et ajouter 100ml
du tampon TBE (1×). Placer au four à micro-ondes jusqu’à ébullition et obtention d’une phase
homogène (limpide). Laisser refroidir jusqu’à ce qu’il soit possible de tenir l’erlenmeyer dans
la main, et, dans l’agarose encore liquide. Ajouter 2µl de bromure d’éthidium (BET) à
10mg/ml.

ATTENTION : ce produit se liant à l’ADN est donc hautement mutagène et donc

cancérigène, par contact seulement : il est donc absolument INTERDIT de manipuler sans
gants

Mélanger puis verser dans la cuve horizontale d´électrophorèse sur laquelle est fixé un peigne.

Lorsque le gel est solidifié, enlever le peigne puis recouvrir le gel par le tampon TBE (1×).

Préparation et dépôt des échantillons à faire migrer :

Déposer les échantillons d’ADN plasmidique (12µl) mélangés avec la solution de dépôt, dans
les puits.

Migration :

Remplir la cuve de tampon TBE 1x, immerger le gel et son support dans la cuve de migration.

Laisser migrer environ 1h à 100 Volts

Visualisation :

Enlever éventuellement le gel du support

Placer le gel sur le trans-uliminateur UV

ATTENTION : les UV peuvent causer de très graves brûlures aux yeux notamment, ils
sont également mutagènes et donc potentiellement cancérigènes du fait de leur absorption
par l’ADN et des modifications qu’ils peuvent lui causer. Ils sont par contre très peu
pénétrants et sont arrêtés par le verre, le plexiglas, l’eau, etc. Il est donc OBLIGATOIRE
de fermer la plaque de protection de la table à UV et d’utiliser des gants pour manipuler les
gels.

Analyser les résultats

8
Bon courage