Extraction, purification, analyse et caractérisation de polysaccharides

marins

Rappel :
L’alginate est un polysaccharide constitué d’un enchaînement de deux types d’acides uroniques :
l’acide β-1,4-D-mannuronique (M) et son épimère, l’acide α-1,4-L-guluronique (G), qui diffère par
l’orientation du groupement carboxylique en C5 :

La structure et les propriétés physico-chimiques de l’alginate dépendent du degré de polymérisation

mais aussi de l’abondance et de l’enchaînement des motifs M et G (Wong et al., 2010).

Matériels et Méthodes

J1 : Extraction des polysaccharides (~ 2h30)

Allumer la plaque chauffante.
Peser 20 g d'algue séchée et broyée. Extraire les algues avec :
- 100 mL d’acétone (à température ambiante) sous agitation pendant 20 min.
- 100 mL d’éthanol à chaud sous agitation pendant 20 min.
- 200 mL d'eau distillée ajustée à pH 9 à 80°C sous agitation pendant 1h.
Pendant ce temps, préparer un volume d'éthanol équivalent : le refroidir dans un bain de glace.
Au bout d’1h, filtrer si besoin la solution aqueuse sur un morceau de tulle. Vérifier que le pH de la
solution est à une valeur de 8-9 ; ajuster à l'aide de la soude ou d'HCl 1N si besoin, goutte à goutte,
en contrôlant avec du papier pH. Laisser refroidir.
Verser la solution éthanolique refroidie sous agitation manuelle. Laisser précipiter à froid pendant
10 min.
Filtrer sur toile et presser à la main. Désagréger le coagulum à la main de façon à obtenir des fibres
les plus fines possibles et les laver à l'éthanol.
Sécher les fibres obtenues à l'étuve une nuit. Peser et calculer le rendement d'extraction.

J1 ou J2 : Analyse chromatographique sur couche mince (~ 1h)

Déposer 5 μL de solution à 100 mg/mL d’extrait polysaccharidique sur une plaque de silice. Pensez
à déposer des standards disponibles. Eluant : n-butanol/acide acétique/eau (3:2:2, v/v/v) pendant
environ 1 heure. Les oligosaccharides étant incolores, un révélateur est utilisé pour permettre
l’apparition par réaction chimique des sucres : mélange éthanol/acide sulfurique (9 :1, v/v)
contenant de l’orcinol à 0,1%. Une fois l’immersion complète de la plaque CCM, elle est séchée
puis placée à l’étuve à 100°C pendant 10 min.

J2 : Dosages colorimétriques (~ 3h30)

Détermination de la concentration des oses neutres totaux (méthode de

Dubois et al. 1956)
Faire une gamme étalon de D-glucose de 0, 50, 100, 200 µg/mL à 1 mg/mL dans des tubes à essai
(~10 mL).
Préparer 3 solutions polysaccharidiques aux concentrations de 250 µg, 500 µg et 1 mg/mL.
Prélever 200 µL de la gamme étalon et des 3 solutions polysaccharidiques et ajouter 200 µL d'une
solution aqueuse de phénol à 5 %.
Le mélange est homogénéisé au vortex ; 1 mL d'acide sulfurique concentré est rapidement introduit
à la pipette dans le milieu réactionnel.
ATTENTION : le phénol et l'acide sulfurique doivent être manipulés sous la hotte
Après 10 min. à T° ambiante (idéalement 5 min au bain-marie à 100°C), les tubes sont refroidis
dans un bain de glace et placés 30 minutes à l'obscurité.
Lire les DOmax des chromophores formés à 491 nm.

Détermination de la teneur en groupements sulfates

L'étalonnage est réalisé à l'aide d'une série de dilutions du Dextran sulfate de 0 à 1 mg/mL.
Tester la solution polysaccharidique aux concentrations de 250 µg, 500 µg et 1 mg/mL.
Chaque tube à essai recevra :
- 1 ml de solution (ou de Dextran pour la gamme)
- 4 ml d'acide acétique (0,5 M, d = 1,049)
- 50 µl d’Azure A à 10 mg/ml
Agiter au vortex pour homogénéiser et incuber pendant 12h.
Centrifuger à 4000g pendant 20min si besoin et lire la DO à 610 nm au spectrophotomètre

J3 : Analyse spectrale
IR + Maldi-Tof
Maldi : L'acide 2,5-dihydroxybenzoïque est particulièrement adapté à l'étude des oligosaccharides