UNIVERSITE MOHAMMED V

FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE RABAT

2me ANNEE DE PHARMACIE

TRAVAUX PRATIQUES.
TOXICOLOGIE I
Pr. Y. CHERRAH

Pr. A. ZELLOU Pr. S. SERRAGUI

Laboratoire de Pharmacologie Toxicologie 2007-2008

Remerciements

Je tiens remercier Monsieur le Professeur L. EL IDRISSI pour sa collaboration scientifique et pour son

aide en matriel dans un climat de confiance et d'amiti.

RECOMMANDATIONS AUX TUDIANTS

. Il est impratif de respecter la

rpartition des groupes de TP

. Le port de la blouse blanche est obligatoire pendant les sances.

. Chaque tudiant avant de quitter la salle doit nettoyer sa paillasse ainsi que le matriel utilis.

SOMMAIRE RECHERCHE ET DOSAGE DE L'ETHANOL1 RECHERCHE DES BENZODIAZEPINES.....7 RECHERCHE ET DOSAGE DES SALICYLES....11 DOSAGE DU PARACETEAMOL SERIQUE EN CAS D'INTTOXICATION METHODE DE GLYNN ET KENDAL-197514 ACTIVITE CHOLINESTERASIQUE....16 RECHERCHE TOXICOLOGIQUE DES ANTICOAGULANTS......20 RECHERCHE ET DOSAGE DES BARBITURIQUES...23 RECHERCHE ET DOSAGE DES PHENOTHIAZINES ET DES IMIPRAMINES......27

RECHERCHE ET DOSAGE DE L'ETHANOL

I/Recherche A/ Test de Curry 1- Principe La recherche de l'alcoolmie par le test de Curry peut tre effectue sur sang total prlev sur fluorure de sodium.On utilise des cellules de Conway. 2- Ractifs: Solution sature de carbonate de potassium dans l'eau distille (K2CO3) Ractif A: Acide sulfurique pur (d=1,83) Ractif B : Solution 0,1 N de bichromate de potassium Bichromate de potassium.4,90 g Eau distille q.s.p .1000ml Ractif sulfochromique prpar extemporanment Mlanger 100 ml de A et 1000 ml de B. 3- Matriel : Cellule de Conway. Table oscillante de Dale.

4-Mode opratoire : Dans le compartiment central d'une cellule de Conway, placer 1ml de ractif sulfochromique. Dans le compartiment latral, placer 1ml de sang et, l'oppos, 1ml de solution sature de carbonate de potassium. Fermer la cellule , l'tanchit tant assure, mettre en contact le sang et la solution sature de K2CO3 par un doux mouvement de rotation. Placer la cellule sur la table oscillante pendant quinze minutes Faire un tmoin dans les mmes conditions, ezn remplaant le sang par un millilitre d'eau distille (ou 1ml de sang frais ne contenant pas d'alcool). 5- Rsultats et interprtation: Aprs quinze minutes, placer la cellule sur fond blanc et examiner le compartiment central aprs avoir homognise le contenu l'aide d'un petit agitateur en verre trs important Comparer la coloration de la solution tmoin . Si la coloration reste jaune sans aucun changement : Alcoolmie <0,5 g par litre . Si la coloration jaune virera au vert ou bleu : Alcoolmie >0,5 g par litre. le changement de la teinte de la coloration n'est que pour des taux voisins ou suprieurs 1 gramme par litre . Dans ce dernier cas, il est ncessaire deffectuer un dosage selon la mthode habituelle ,de faon prciser le taux d'alcool dans le sang. avec celle du

B/ Alcotest 1- Principe : L'ALCOTEST permet de dceler la prsence d'alcool dans le sang partir de l'air expir. Elle est utilise par la prvention routire. Le principe de cette technique est bas sur le fait qu'environ 2 L d'aire alvolaire contiennent la mme quantit d'thanol qu'un ml de sang. 2-Description du matriel Alcotest: Les boites ALCOTEST contiennent 10 tubes ractifs, 10 embouchures strilises et un poche en matire plastique. Les tubes . ALCOTEST, scells aux deux extrmits, contiennent une masse ractive jaune qui se colore en vert en prsence de vapeurs d'alcool. Sur le tube ALCOTEST sont imprims: a) une flche indiquant le sens dans lequel doit tre expuls l'aire expir; b) un anneau repre blanc, qui divise la coluche ractive jaune en deux parties gales. 3- Conditions de conservation et d'utilisation: Les tube Alcotest peuvent tre stocks pendant 3 ans, la condition d'tre conservs sous emballage ferm l'abri de la lumre et une temprature infrieures 30C. Toutefois avant utilisation, on s'assurera que le contenu des tubes ALCOTEST est toujours d'un jaune pur.

4-Mode d'emploi: a) - Prlever un tube de la boite Alcotest ; - Saisir ce tube le plus prs possible de la pointe ouvroir; - Entamer la pointe en l'appuyant lgrement sur la petite scie se trouvant sur le ct de la bote; - Briser la pointe dans l'ouverture prvue cet effet; - Casser de mme l'autre pointe (voir fig.1). b)Placer le tube dans l'orifice de la poche en matire plastique vide, c'est--dire aplatie, de telle sorte que la flche imprime sur le tube soit dirige vers la poche (voir fig.2). c) Aprs avoir enlev le papier recouvrant une embouchure (voire fig.3): Faire entreR en force le tube Alcotest dans cette embouchure, en tenant le tube entre le pouce et l'index et en vitant soigneusement de toucher l'embouchure;

Lembouchure peut alors tre retire de la boite dans laquelle elle est place (voir fig.3) Pour procder une preuve, le sujet doit remplir compltement et dans toute la mesure du possible en une seule expiration, la poche en matire plastique par l'intermdiaire de l'embouchure et du tube ALCOTEST; Cette opration doit durer au minimum 10 secondes et au maximum 20 secondes (voire fig.4); Aprs usage sparer le tube de la poche en tenant celle-ci par son embout!

5-Rsultats:

Sera considre comme positive toute preuve dans laquelle la masse ractive jaune virera au vert; L'preuve de L'ALCOTEST doit faire au plus tt 15 minutes aprs l'absorption de boissons alcoolises ou aromatiques (jus de fruit). Ce temps d'atteinte est galement ncessaire aprs utilisation d'un vaporisation buccale; De plus, la personne tester ne doit pas fumer ou sucer de bonbons alcooliss, ni immdiatement dans les 15 minutes prcdant l'preuve, ni pendant le test. La coloration brune rsultat d'une forte proportion de fume de tabac, peut altrer la coloration ractive initiale. Dans ce cas le contrle doit galement tre rpt aprs 15 minutes.

II/ DOSAGE PAR LA MTHODES DE CORDEBARD 1/Principe: Extraction de l'alcool par distillation en prsence d'acide picrique et oxydation froid le bichromate de potassium en solution azotique, selon le principe indiqu par CORDEBARD. CH3 CH2 OH+ O2 CH3 COOH + H2O 2-Matriel : o Appareil de SCHLOESING-AUBIN .1 o Ballon jaug de 250 ml1 o Chauffe ballon .1 o Rfrigrant ...1 o Cristallisation de 500ml....1 o Erlenmeyers de 250 ml bouch meri..2 o Burette gradue en 1/20me de ml.1 o Billes de verre lave au sulfochromique o Bchers de 100ml;2 o Eprouvettes de 50 ml3 o Pipettes gradues o Pissette..1 o Entonnoir ..1 3-Ractifs : Solution sature d'acide picrique 1,5% HOC6H2(NO2) 3 : 15g environ d'acide picrique sont dissous chaud dan 800ml d'eau bidistille. Porter la solution bullition durant 10 minutes pour chasser les matires volatiles ductrices. Aprs refroidissement complter 1000 ml avec de l'eau distille. Utiliser la solution sature surnageante.
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Solution nitro-chromique N/10: - Bichromate de potassium pur et sec .4g. - Acide nitrique pur d =1,39 (exempt de vapeurs nitreuses prparant, barboter pendant 15 minutes un courant d'air filtr sur tampon de coton)q.s.p. 1000ml Thiosulfate de sodium N/10. Iodure de potassium pur. 4- Mode opratoire: a) Extraction : Avant de faire l'extraction, il est ncessaire de nettoyer trs soigneusement les diffrentes pices de l'appareil au mlange sulfochromique et de les laver ensuite plusieurs fois l'eau distille. Complter le nettoyage en distillant dans lappareil mont , 400 500 ml deau distille dont on recueille 250 300 ml qui serviront rincer le ballon distillatoire et la verrerie. Introduire 10 ml de sang rcolt sur oxalate ou sur fluorure de sodium, en agitant constamment, dans le ballon de l'appareil d'Aubin renfermant 60 ml de solution sature d'acide picrique, et quelques billes de verre. Distiller 20 30 ml dans une prouvette jauge de 50 ml refroidie par de la glace et pralablement garnie de 15 ml d'eau distille en ayant soin que le tube terminal de l'appareil plonge jusqu'au fond de l'prouvette jauge dans cette eau distille . La distillation termine, rincer le tube et complter 50 ml l'aide d'eau distille, agiter.

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b) Dosage : Introduire successivement dans un erlenmeyer B.E de 250 ml : 10 ml de solution nitro-chromique N/10 et 5 ml de distillat. Boucher, agiter en tournant pendant 5 minutes. Ajouter alors 40 ml d'eau distille. Introduire 1g d'iodure de potassium et 100 ml d'eau distille prpar l'instant .Aprs une minute de contact, verser la burette le thiosulfate de Na N/10 = X1 jusqu' disparition de la coloration jaune et virage au bleu des sels de Cr. Faire le mme essai tmoin en remplaant le distillat par 5 ml d'eau distille soit X2 . c)Taux de l'alcoolmie: (X2ml-X1ml) x 1,15 = poids d'alcool /litre de sang. Gr d'alcool / litre de sang.

Alcoolmie Infrieur ou gale 0,50g/l 0,50-1g/1

1-1,50g/l 2g/1

Clinique Pas de signes cliniques apprciables Pas de symptmes apparents Diminution du pouvoir de concentration. Tout sujet sensible ou hypoglycmique prsente un tat d'brit. Ebrit. A 1,50 g/L, L'ivresse est caractrise Perte de l'attention et incoordination motrice. L' ivrese peut rester inapparente chez une petite minorit. Coma thylique Seuil des concentrations mortelles Mort quasi-certaine

3-4g/1 5g/1 8-10g/1

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RECHERCHE DES BENZODIAZEPINES

I- Par raction de coloration: 1-Principe : Recherche des benzodiazpines

Aprs hydrolyse acide partir d'urines 2-Ractifs : o Acide chlorhydrique 6N. o Nitrite de sodium. o Sulfamates d'ammonium. o Ractif de Trfoul (Sol.aqueuse de chlorhydrate de N-alphaNaphtyl N, N diethylpropylne 0,1%) 3-Matriel : Tubes essais Porte tubes essais Pipettes Eprouvettes de 10ml

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4- Technique : Mettre dans trois tubes essai 1ml d'urine et 1 ml d'acide chlorhydrique 6N.Introduire les deux derniers au bain marie bouillant pendant 10 minutes, refroidir ces derniers sous un courant d'eau froid puis ajouter dans chaque tube 0,5 ml de sulfamates d'ammonium et 0,5 ml du ractif de Trfoul. La prsence des benzodiazpines se traduit par l'apparition d'un spot violet. II- Par spectrohotomtrie: 1-Principe : Les benzodiazpines sont extrait partir du sang en milieu acide PH=6,7 par l'ther. Le dosage consiste rechercher le maximum d'absorption. 2- Ractifs: Ether. Solution tampon pH =6,7. Soude 0,1N. Acide chlorhydrique 2N. 3-Matriel: o Tubes essais o Porte Tubes essais.1 o Ampoule pied... 1 o Verre dcantation..1 o Micropipettes de 1 ml ..1 o Pipettes 4-Technique : Mlanger : 6,5 ml d'ther. 1 ml de la solution tampon pH =6,7.
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0,5 ml d'eau distille. 1 ml du sang Agiter au vortex pendant 3 secondes, centrifuger. Mettre le mlange dans une ampoule dcantation, rcuprer la phrase thre puis rincer cette phase avec: 1er avec 3 ml de Na OH 0,1N 2me avec 2 ml d'eau distille. Faire un spectre d'absorption dans L'U.V entre (200-400) nm contre HCI 2N. 5- Rsultats: a) Chercher le maximum d'absorption.

b) Calculer le coefficient d'extinction molaire.

III- Par CCM:

1-Principe : Les drivs benzodiazpiniques et leurs mtabolites prsents prsents dans les urines conduisent, par l'action hydrolysante de d'acide chlorhydrique et 100C, la formation de drivs qui, spars par chromatographie sur couche mince, permettent l'identification partielle des benzodiazpines mais, surtout, le classement du compos absorb en fonction de son activit thrapeutique. 2-Ractifs: o Acide chlorhydrique pur (d=1,18). o Ether thylique. o Acide chlorhydrique N. o Sulfate de sodium anhydride.
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o Ethanol 95. o Nitrite de sodium 0,5%. o Ractif de trfouel (solution aqueuse 0,1% de chlorhydrate de Nalpha-naphtyl N,N diethylpropylne). 3 - Matriel : Erlenmyers de 250 ml B.E..2 Bchers de 250 ml 2 Bchers de 100ml.2 Ampoules dcantation .2 Pipettes (types pasteur) . Plaques recouvertes de silicagel. Lampe ultraviolette. Entonnoirs2 4- Mode opratoire : - Prparation des drivs dhydrolyses : Dans un erlenmeyer de 250 ml bouchant meri, placer 5 ml durines et 2 ml dacide chlorhydrique (d= 1,18). Porter le mlange pendant 5 minutes au bain marie 100C. Aprs refroidissement ,extraire les produits dhydrolyse par 10ml dther thylique . Aprs sparation, la phase thre est lave deux fois avec 5ml de solution aqueuse dacide chlorhydrique N, puis deux fois avec 5 ml deau distille. Aprs dshydratation par agitation avec du sulfate de sodium anhydre, l'extrait thr est vapor. La solution dans L'thanol 95 du rsidu d'vaporation est soumise l'analyse chromatographique.
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5-Analyse chromatographique : a-Absorbant : Couche mince d'oxyde d'aluminium F 254 ; type F, Merk n 5713/0025 plaque prtes l'emploi conserves en dssicateur . b-Substance de rfrence : Benzophnome :3/1. c-Solvant de migration : - Benzne-chloroforme : 3/1. - Migration : 10 12 cm. 6-- Rvlation : - Sous lampe ultraviolette 254 nm - Raction de diazocopulation : Pulvriser sans excs une solution de nitrite de sodium 0,5% dans l'acide chlorhydrique (d=1,18)au 1/10 (prpare extemporanment).Attendre cinq minutes. Scher la plaque sous un courant d'aire tide. Pulvriser enfin le ractif de Trfouel solution aqueuse 0,1% de chlorhydrate de N-alpha naphtyl N, N-dithylpropylne diamine .Les sports correspondant aux amines aromatiques primaires apparaissent en quelques minutes colors en violet. La coloration s'intensifie plus rapidement en plaant les chromatoplaques +50C.

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RECHERCHE ET DOSAGE DES SALICYLES

1-Principe : Dosage colorimtrique de lion salicylique en prsence de sels ferriques donne la formation d'un complexe chelat pourpre. 2-Ractifs : a) Ractif de Trinder (ractif I): chlorure mercurique .40g Eau distille.850 ml Chauffer pour dissoudre. Aprs refroidissements, ajouter : Nitrate ferrique (NO 3 ) 3 Fe, 9H2O40g HCI N 120 ml Ce ractif est stable indfiniment. b) Solution aqueuse talon de salicylate de sodium (ractif II): - Salicytate de sodium.580mg - Eau distille.250 ml - Chloroforme..1 ml la concentration de cette solution en acide salicylique est de 2g/l. Elle se conserve plusieurs mois 4C au rfrigrateur.

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3-Matriel : -Ampoules dcanter.2 Verres pied de 100ml 2 Bchers de 100 ml 2 Tubes essais Porte tubes essais.1 Porte ampoule dcanter 1 Micropipette de 1 ml 1 Entonnoirs 2 4- Mode opratoire : a) Extraction et raction colore 10 20 g d'chantillon sont puiss par de l'Ether en milieu acide, la phase organique recueillie est vapore sec, puis additionne de quelques gouttes du ractif de Trinder. Si l'addition de ce ractif se traduit par une coloration violette, on en conclut la prsence des salicyls. b) Etalonnage : La solution talon de salicylate de sodium est dilue au 1/5 dans l'eau distille (ractif III). La concentration en acide salicylique est alors de 400 mg/l. Prparer comme suit une gamme talon: Ractif III Eau distille Ractif I Concentration d'acide salicylique mg/L en 00 1 5 0 0,2 0,8 5 80 0,4 0,6 5 160 0,6 0,4 5 240 0,8 0,2 5 320 1 0 5 400

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Agiter; Attendre 5 min; Centrifuger; Attendre 20 min; Lire les DO au spectrophotomtre 530 nm. Dduire la courbe d'talonnage. c) Dosage des salicylates: * Apartir de la courbe d'talonnage. Recueillir le sang sur hparine.Oprer sur le plasma ou le sang total. Dans un tube centrifuger introduire: - Plasma ou sang total..1ml - Ractif de Trinder .5 ml Agiter; Attendre 5 min; Centrifuger; Attendre 20 min; Centrifuger; Prlever le liquide surnageant; Lire au spectrophotomtre 530 nm ; Dduire d'aprs la courbe d'talonnage la concentration en mg/l de votre chantillon.

* A partir de la mthode des trois points. Dans des tubes centrifuger de 10 ml, placer:

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- Eau distille -Plasma ou (ventuellement dilue) - Solution talon Ractif de Trinder

urine

Tube n1 2ml 5ml

Tube n2 1ml 1ml 5 ml

Tube n3 1ml 1ml 5ml

Agiter; Attendre 5 min; Centrifuger; Attendre 20 min; Prlever le liquide surnageant; Mesurer rapidement les Do au spectrophotomtre 530 nm (Zro de Do faire sur le tube N1) 5- Rsultats: Sachant que la concentration en mg d'acide salicylique /l est : (400* DO2)/ (DO3-DO2) (DO: Densit optique) a) Dterminer la concentration en mg/l des salicyls de votre chantillon. b) Comparer les rsultats des deux mthodes.

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DOSAGE DU PARACETAMOL SERIQUE EN CAS D'INTOXICATION METHODE DE CLYNN ET KENDAL-1975

I- Principe Aprs dfcation des protines par l'acide trichloractique et sous l'action de l'acide nitreux naissant, le paractamol est transform en un driv nitreux qui se colore en jaune orang en milieu alcalin.

II- Ractifs : 1- Solution aqueuse d'acide trichloractique 10%. 2- HCl pur d=1,19 . 3- Solution aqueuse de Na NO 2 (prpare extemporanment) (2g/10 ml d'eau).

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4- Solution aqueuse de sulfamate d'NH 4 NH 4 SO 3 NH 2 30%. 5- Solution de Na OH 25% 6- Solution talon de paractamol 1mg/ml dans l'eau distille. III-Matriel: 1- Tubes centrifuger de 10 ml en plastique 2-Cuve photomtrique. IV- Mode opratoire: A partir d'une solution de paractamol 1mg/ml, prparer une gamme d'talonnage dans des tubes centrifuger de 10 ml. Concentration (g/ml) Serum temoin (ml) Solution Paractamol (l) Eau distille (l) Actrichloroactique (ml) 0 1 200 2 50 1 50 150 2 100 1 100 100 2 200 1 100 100 2 Echan 200 2

- Agiter au vortex pendant 1minute - Mettre 2 ml du liquide dans un autre tube - Ajouter 0,5 ml d'HCI pur et 1 ml NaNO 2 20% - Agiter la main et attendre 2 minutes - Ajouter trs doucement 1 ml de sulfamate d'NH4 30% et 2ml de NAOH 25% - Agiter au vortex 15 secondes - Lire l'absorbance 430nm - Tracer la courbe d'talonnage et en dduire la concentration du paractamol dans votre chantillon X

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- Sachant que le taux srique toxique est suprieur 50mg/l aprs 1O heures d'ingestion ou 200mg/l aprs 2 heures, qu'en concluez-vous ? Remarque : L'emploi du sulfamate d'ammonium pour but de dtruire l'excs de NaNO qui pourrait gner le dveloppement de la coloration, ce qui conduit un dgagement d'azote.

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ACTIVITE CHOLINESTERASIQUE
1- Principe: Certains insecticides comme les organo-phosphors ou les carbamates sont des inhibiteurs de la cholinestrase qui est un enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'actylcholine en acide actique et choline. Au laboratoire, l'activit cholinestrasique est value en mesurant la variation de pH due la libration de l'acide actique partir du substrat actyl-choline pendant un temps dtermin.

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2- Ractifs: 1- Eau distille exempte de CO 2 (Sans CO 2 )faire bouillir 500 ml d'eau distille pendant 10mn et la laisser l'abri de l'air. Cette eau servira la prparation des ractifs 1 et 2. 2- Ratif 1: Solution de Bleu de Bromothymol (B.B.T) - Bleu de Bromothymol100mg - NaOH 0,05 N..3,2 ml - Eau distille exempte de CO 2 ..100ml Vider les tubes du contenu de B.B.T et du NaOH dans une fiole de 100 ml et la remplir moiti avec de l'eau distille exempte de CO 2 Boucher tout de suite la fiole. Mlanger lgrement et la laisser reposer 1heure. Ensuite complter avec l'eau distille exempte de CO 2 juqqu' 100ml. Cette solution peut se conserver plusieurs mois l'abris de la lumire et de la chaleur. 3- Ractif 2: Solution de substrat - Chlorhydrate d'actylcholine .une pince - Eau distille exempte de CO 2 50 ml Remplir l'extrmit de la spatule de substrat (le chlorhydrate

d'actylcholine). L'introduire dans le flacon marqu " substrat" Ajouter 50 ml d'eau distille exempte de CO 2 . La solution de substrat doit tre prpare chaque jour. Il faut la dposer l'abri de la chaleur.

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3- Mode opratoire Suivant le nombre de personnes qui seront soumises l'valuation de l'activit cholinestrasique, prendre une srie de petits tubes du kit lovibond mis votre disposition. Numroter les 2 premiers tubes de la faon suivante: - 1er tube: Tmoin Blanc (T.B) - 2me tube : Tmoin Raction (T.R) Les autres tubes serviront pour les personnes tester La raction se fera de la faon suivante: Tube Blanc (T.B) 10l Tube Tmoin (T.R) 10l Tubes malades ou personnes tester -

Sang du sujet non expos au pesticides Sang des malades ou personnes tester Eau distille sans CO 2 Indicateur B.B.T

1ml -

0,5ml

0,5ml

- Bien mlanger le contenu de tube blanc avec la micropipette et le transfrer dans la cuve de 2,5 mm. La placer dans le compartiment gauche du comparateur. Les tapes ci-dessus doivent tre excut la minute prs . - Ajouter 0,5 ml du substrat dans le tube tmoin . boucher et mlanger par retournement. Transfrer dans la cuve de 2,5 mm et le placer dans le compartiment droit du comparateur.

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- - Noter l'heure la minute prs : c'est le temps zro. Lire immdiatement dans le compartiment droit. Le rsultat doit tre infrieure ou gal 12,5%. - A intervalle d'une minute, ajouter 0,5 ml de la solution de substrat dans le tubes " personnes tester" en prenant la prcaution de respecter l'intervalle de 1 minute entre les 2 tubes. - Attendre que l'chantillon contrle atteigne 100% d'activit cholinestrasique en lisant contre l'chantillon blanc dans le compartiment gauche. Le temps d'incubation dpend de la temprature ambiante et varie en gnral entre 18 et 30 minutes. - Lire chaque chantillon des personnes tester 1 minute d'intervalle. - Noter le pourcentage d'activit cholinestrasique. Interprtation des rsultats % Activit cholinestrasique 100% -75% Interprtation et mesure prendre Aucune action prendre Refaire ultrieurement l'analyse dans un proche avenir Exposition probable Si le taux est confirm, carter le sujet expos de tout travail en contact avec les pesticides Surexposition grave : Refaire le test si confirm, suspendre imprativement tout travail en contact avec les pesticides, un suivi mdical et ventuellement un traitement sera instaur. Surexposition svre et dangereuse Refaire le test, si confirm :Arrt imprativement immdiat de tout contact avec les pesticides. Envoi immdiat du sujet dans un centre hospitalier.
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75% - 50%

50% - 25%

25%- 0%

RECHERCHE TOXICOLOGIQUE DES ANTICOAGULANTS

Les anticoagulants utiliss comme raticides sont susceptibles d'entrainer des intoxications chez les animaux domestiques et sauvages. Certains composs peuvent ,tre utiliss chez l'homme pour leurs proprits anticoagulants. La recherche toxicologique de ces composs est longue et dlicate. Elle ncessite aprs extraction et purification, l'analyse soit par chromatographie en phase gazeuse, soit par spectrophotomtrie ultraviolette. Cependant lorsque les quantits recherches sont relativement importantes une mthode simple et rapide par chromatographie sur couches minces peut tre mise en uvre. 1- Principe: Aprs extraction par le chloroforme, on effectue une sparation et une purification de l'extrait par chromatographie sur couches minces. L'identification de l'anticoagulant se fait par comparaison avec des solutions talons ayant subi la mme chromatographie. 2-Formules gnrales: a) les coumariniques: Dicoumarol,Coumafne, Coumachlore

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b) Indandiones : Chlorophacinone.

3- Matriel : Plaques de verre recouvertes de silicagel2 Pipette (types Pasteur). Ampoules dcanter de 125ml2 Bchers de 100ml.2 Bchers de 250ml..2 Eprouvette de 100ml......1 Pipette gradue(1 de 2 ml), (1 de 10ml) Pissette1 Papier filtre Etuve. Lampe ultraviolette . Cuve de dveloppement..1 4- Ractifs: Gel de silice HF. Au cours de cette sance de TP les plaques sont fournis recouverts du silicagel (paisseur de la couche 0,2mm). Ether. Benzne. Chloroforme.
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Actone. Iode (en cristaux). Solutions talons d'anticoagulants soit dans le chloroforme soit dans la l'actone. - Coumaphne - Coumachlore - Dicoumarol - Chlorophacinone - Fassouk. - Brodifacoum - 4- Hydoxycoumarin 3.(A .Acetonylbenzyl). -Racumin

5- Extraction: Oprer sur le prlvement d'appt suspect ou sur le contenu stomacal du chien. Extraire 10 g d'chantillon broy par 50 ml de chloroforme, dans une ampoule dcanter (agiter pendant 10 minutes) Recueillir la phase chloroformique dans un bcher de 100ml Concentrer sec au bain-marie. Reprendre le rsidu Prparer les plaques de verre recouvertes de silicagel HF en disposant sur chaque plaque une tche de chacun des talons et une tche de chacun des deux extraits. 6- Technique: - Prparer l'luant: - Cet luant contient Ether: 60 ml. Benzne:30 ml.
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Actone : 20 ml. - Verser l'luant dans le cuve de dveloppement prpar pour travailler en atmosphre satiure. - Attendre 15 minutes. - Mettre la plaque dans le cuve. - Laisser se dvelopper sur 12 cm environ. - Retirer la plaque, la mettre l'tuve 70Cpendant 5 minutes. - Faire un examen direct sous lampe ultraviolette. Reprer les spots. Dterminer les Rf. - Rvler ensuite chaque plaque avec de l'iode , pour cela chauffer lgrement quelques cristaux d'iode dans un bcher de 100ml. - Tenir les plaques au dessus du Becher en contact avec les vapeurs d'iode. ATTENTION: Ne pas respirer les vapeurs d'iode : Oprer sous hotte. - Reprer les spots, dterminer les Rf. - Comparer les rsultats obtenus par rvlation en ultra violet avec ceux obtenus par l'iode. Qu'en concluez vous?

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RECHERCHE ET DOSAGE DES BARBITURIQUES

I- Formule gnral:

II- Proprits physico chimiques: L'absorption Ultra-violette des solutions aqueuses des barbituriques est intimement lie leur pH, les formes non ionises n'absorbent que trs faiblement. A pH 10, l'absorption est maximale 238nm. Ceci est du l'ionisation de la premire fonction acide . A pH 13, on voit apparatre une deuxime bande d'absorption prsentant un maximum vers 260 nm et qui tmoigne de l'ionisation de la seconde fonction acide. A- Par spectrophotomtrie UV I. Principe : La mthode de dosage prvoit une extraction en milieu acide par le dichloromthane, ou le chloroforme un passage en phase aqueuse alcaline par NaOH 0,45 N et une photomtrie diffrentielle avec lecture 260 nm.

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2-Ractifs: Acide chlorydrique concentr . Dichloromthane. Sulfate de sodium anhydre. Soude 0,45N. Tampon borate0,6M H 3 BO 3 37,2g KCI.4,2 g Eau distille q.s.p 1000ml Solution mre de phnobarbital 2g/l 3- Mode opratoire A partir d'une solution mre de phnorabital 2g/l, prparer une gamme talon comme suit: Tube N Solution PB(2g/l)ml Plasma(ml) Volume final(ml) Dichloromthane(ml) HCI concentr(gouttes) 1 0,1 4,9 5 50 5 2 0,2 4,8 5 50 5 3 0,3 4,7 5 50 5 X 5 50 5

Agiter pendant 3 minutes.

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Filtrer sur un papier filtre contenant 10g de sulfate de sodium anhydre. Dans une ampouler dcanter, mettre 30 ml du filtrat. Ajouter 6 ml de soude 0,45N. Agiter pendant 3 minutes. Centrifuger la phase sodique (Phase suprieure). Pour chaque concentration, prparer les solutions suivant le protocole cidessous: pH10.1,5ml de L'extrait 1,5ml de tampon borate pH13.1,5ml de L'extrait 1,5ml de soude 0,45N Faire la lecture 260nm pH10(blanc:1,5ml NaOH 0,45N+ 1,5 ml Tampon borate) et pH 13 (blanc : soude 0,45N) Faire la diffrence des DO. Tracer la droite d'talonnage. Dterminer la concentration inconnue de l'chantillon.

B- Par raction de Parri 1- Ractifs Ether thylique. Acide chlorydrique (d=1,18). Sulfate de sodium anhydre. Alcool absolu. Solution alcoolique de nitrate de cobalt 3%o. Solution alcoolique de diethylamine 3%.
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2- Mode opratoire: 10 20g d'chantillon sont puiss par l'ther en milieu acide, la phase organique recueillie est vapore sec , puis additionne de 1 ml d'thanol, 1 ml de solution alcoolique de nitrate de cobalt 3% et 1 ml de la solution de diethylamine 30%o. La prsence de barbituriques se traduit par une coloration violette et stable. C- Par C.C.M 1-Ractifs: - Chloroforme. - Actone. - Diethylamine. - Chlorure mercurique. - Diphnylcarbazone. 2- Analyse chromatographie: * Absorbant : Gel de silice. * Eluant: Chloroforme / Actone : 90/10. * Rvlateur : - Sous lampe ultra-violette 254 nm - Pulvriser avec le dithylamine pur, scher puis pulvriser avec un mlange de volume gal de chlorure mercurique et de diphnyl carbazone. 3- Interprtation :
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La prsence de barbituriques se traduit par un spot rose sur fond violet.

IDENTIFICATION DES PHENOTHIAZINES ET DES IMIPRAMINES

I- INTRODUCTION La trs grande utilisation des drivs phnothiaziniques et des antidpresseurs (type imipramine) et leur grande diffusion en thrapeutique ambulatoire font que ces mdicaments sont frquement absorbs des fins suicidaires ou accidentellement. De plus l'association frquente de ces mdicaments psychotropes conduit un grand nombre d'intoxication mixte, ce qui justifie leurs recherche en toxicologie d'urgence. II- RECHERCHE DES PHENOTHIAZINES ET IMIPRAMINE :

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A Par Raction colore 1. Phnothiazines : * Ractif : FPN ou universel - Solution aqueuse d'acide nitrique(d = 1,38) 50% en volumes 50 ml - Solution aqueuse d'acide perchlorique(d=1,67) 20%en volume 45 ml - Solution aqueuse de chlorure ferrique 5 g/100ml 5 ml

Une raction colore en rouge apparat en moins de dix secondes par le mlange d'un volume d'urine un volume de ractif , traduit la prsence de drivs phnothiaziniques. 2. Imipramine: * Ractif : Forrest ; - Solution aqueuse d'acide sulfurique(d = 1,83) 30% en volumes 50 ml - Solution aqueuse d'acide nitrique (d=1,38) 50%en volume - Solution aqueuse de bichromate de potassium 0,2g/100ml 50 ml 50 ml

-Solution aqueuse dacide perchlorique (d=1,67 20%en volume 50 ml le mlange de deux volumes de ractif un volume d'urine conduit, en prsence d'imipramine, l'apparition en 20 secondes d'une coloration bleu vert plus au moins intense.

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B- Par CCM : Absorbant: Gel de silice Migration :10 12 cm partir de la ligne de dpt et aprs saturation de la cuve durant une heure. Eluant : Tolune/actone (80/20)+ un bcher d'ammoniaque Dpt des solutions talons : Chlorpromazine, Largagtil* (pour phnothiazine) Tofranil* (pour imipramine) Rvlateurs : Acide phosphorique , puis aprs schange, pulvrisation du ractif au chlorune ferrique. Interprtation : Prsence des phnothiazines : Spot rouge Prsence des imipramines : spot bleu.

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DOSAGE DES PHETHIAZINES

1- Ractifs - Le Largagtil* contient 25mg/5ml. - Dichlormthane; - Solution de quinhydrone 10 3 M dans le dichloromthane (1) ; - Solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 40 grammes pour 100ml; - Acide ortho-phosphorique (d = 1,71). II- MODE OPERATOIRE A/ URINE Applicable galement aux liquides gastriques . 1-Extraction : Dans des ampoules dcantation placer respectivement comme suit: Ampoules B 1 2 3 Urine 25ml 25ml 25ml 25ml NaOH 1 1 1 1 Dichlorometh 25 25 25 25 Phenothiazine 30 60 90

Agiter nergiquement durant dix minutes. Aprs dcantation, centrifuger grande vitesse la phase organique. Eliminer par aspiration la totalit de la couche

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aqueuse surnageante. Il est inutile de laver l'extractum organique et de dshydrater par agitation avec du sulfate de sodium anydre . *Traiter la solution inconnue de la mme manire que les solutions standards. 2- Raction : Dans l'ampoule dcantation placer: - Extractum organique 10ml - Solution 10 3 M de quinhydrone 1ml - Acide ortho-phosphorique (d=1,71).4ml Agiter nergiquement avec prcaution au dbut en raison de la grande volatilit du dichloromthane durant une minute. Aprs dcantation, la plus grande partie de la phase organique suprieure est limine. Le liquide restant est centrifug. Aprs limination par aspiration du solvant surnageant, la phase aqueuse acide colore est soumise l'analyse spectrophotomtrique aprs dilution ventuelle par un volume connu d'acide phosphorique pur de la phase acide si celle-ci trop intensment colore . Lire l'absorbance 527 nm de tout les tubes Tracer la courbe d'talonnage et en dduire la concentration des phnothiazines dans l'chantillon.

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