BELYAGOUBI Larbi  BELYAGOUBI Nabila 2021/2022

Master I : Microbiologie et Contrôle de Qualité

Module : Microbiologie et génie des procédés

Chapitre : Stérilisation des milieux

Malgré l’intérêt des nombreux agents physiques stérilisants tels que les rayons X, les rayons β,
les rayons ultra-violets ou les rayons ultrasons, ceux-ci n’ont pu être appliqués à la stérilisation des
énormes volumes de liquides mis en œuvre dans les industries de fermentation.
La stérilisation des fermenteurs vides par des agents chimiques gazeux est possible (β-
propiolactone, oxyde d’éthylène), mais c’est la vapeur d’eau sous pression qu’est universellement
employée pour la stérilisation des fermenteurs et des milieux de culture, parce que son utilisation
est plus pratiques et moins onéreuse.
Dans certaines fermentations, il est nécessaire de réaliser une asepsie rigoureuse (Tableau 1).
Tableau 1 : Production de tétracycline par Streptomyces aureofaciens
Conditions de fermentation Rendement en fin de fermentation (mg de tétracycline /l)
Asepsie totale 1328
Contamination par une souche de levure
794
(Candida utilis)
La stérilisation par la vapeur, malgré sa simplicité apparente, présente cependant certains
inconvénients :
a- dénaturation des protéines et inactivation de certaines enzymes ;
b- destruction de certaines vitamines et de certains facteurs de croissances ;
c- surchauffage qui entraine la polymérisation de certains composés ;
d- caramélisation des sucres, oxydation des phénols et de l’acide ascorbique, polymérisation
des aldéhydes insaturés, réaction de Maillard.

1- Méthodes de stérilisation :
Les méthodes classiques de stérilisation par la vapeur peuvent se faire de deux manières :
1° En cuves, dans le fermenteur :
Celui-ci est chauffé, soit par injection de vapeur dans le milieu (il faut alors tenir compte du
volume de l’eau ainsi condensée sans la constitution finale du milieu de culture), soit par
chauffage de la cuve et de son contenu portés à une température convenable par de la vapeur
circulant dans un serpentin ou dans une double paroi.
2° Stérilisation continue :
Elle permet un gain de temps et une meilleure utilisation du milieu. Ainsi, dans le cas de la
vitamine B12, on obtient un rendement plus élevé (160%).
Le milieu passe dans un échangeur de température où il est porté instantanément à une
température élevée, puis refroidi.

2- Théorie de la stérilisation :
La destruction des microorganismes par la chaleur
implique, en fait, la perte de leur viabilité (figure 1).

Figure 1 : Destruction des spores d’une souche de

Bacillus stearothermophilus en fonction de la durée de
chauffage à 104°C.

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L’équation suivante représente cette réaction :

dN N : nombre des microorganismes vivants ;
= - kN t : temps ;
dt k : constante de vitesse de réaction.

On préfère souvent utiliser le temps de réduction décimale, D, correspondant à la durée

d’exposition, à la chaleur entrainant la réduction de la population microbienne au 1/10 de sa valeur
initiale.
On pose D = 2,3/k. N0 étant le nombre de cellules vivantes au départ, N le nombre de
survivants au temps t, l’expression devient alors :

pour t = D, log10 N0/N = 1, donc N0/N = 10 d’où l’on déduit que D est le temps nécessaire pour
réduire la population en 1/10 de sa valeur (figure 2).

Figure 2 : Courbe de survie d’une suspension

bactérienne à température constante.

3- Sensibilité des micro-organismes a la chaleur en fonction de la température :

Considérons les 2 courbes de survie d’une même suspension de spores aux températures T1
et T2 (T2 > T1). On note une toute augmentation de la température de chauffage diminue la
constante D (figure 3).
L’expérience démontre que la variation de la constante de temps D en fonction de la
température de chauffage est proportionnelle à D.

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Figure 3 : Courbes de survie à deux températures. Figure 4 : Courbe de réduction thermique première.

On pose Z = 2,3/K’, l’équation se présente sous la forme :

pour T2 - T1 = Z, log10 D1/D2 = 1 d’où D2 = 1/10.D1, donc Z est l’élévation de la température

nécessaire pour réduire la constante de temps D au 1/10 de sa valeur (figure 4).

Tableau 2 : Caractéristiques de la résistance à la chaleur de divers micro-organismes.

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Exemple de calcule  : soit un fermenteur d’environ 50 m3 avec un milieu contenant 4% de corn

steep. Ce dernier est riche en spores. On en dénombre 20 x 106/ml, soit pour la cuve entière :
20 x 106 x 50 x 103 x 103 = 1015 spores.
On veut assurer une stérilisation convenable à 99,9%, c'est-à-dire n’avoir statistiquement
qu’une cuve contaminée pour 1000 fermenteurs. Le nombre total de spores devra passer de 10 15 à
10-3. Il faudra donc chauffer pendant une durée correspondant à (15 + 3) = 18 D. On va porter en
abscisses la température T et en ordonnées le logarithme du temps τ en minutes qui assure pour
chaque température cette réduction désirée. La courbe obtenue ou courbe du temps de destruction
thermique (Thermal Death Time Curve) s’obtient généralement à partir de la courbe de réduction
thermique première par une translation d’amplitude de log10 18 (figure 4 et 5).

Figure 5 : Courbe du temps τ de destruction

thermique (TDT).

En effet :
τ (mn) = 18 D d’où log10 τ = log10 18 + log10 D.
On a la relation suivante :

F étant la valeur de τ pour T = 121°C, c'est-à-dire la durée de chauffage à 121°C nécessaire

pour assurer la diminution souhaitée du nombre de spores. On utilise souvent des degrés
Fahrenheit (121°C = 250 °F).
Z est le nombre de degrés correspondant à la réduction de 90% de la durée de chauffage, ce qui
se traduit par la traversée d’un cycle logarithmique par la courbe (figure 5).
Cette équation peut s’écrire de deux manières :

Si l’on veut conserver 90% de la thiamine, on trace sur le même graphique la courbe du temps
de destruction thermique de Bacillus thermoacidurans et celle correspondant à un taux de
destruction de 10% de la thiamine. On retiendra alors la zone correspondant aux deux exigences,
soit la destruction du nombre des spores désiré et la destruction de moins de 10% de thiamine. On
adoptera donc comme barème la partie comprise entre les 2 courbes renforcées (figure 6).

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Figure 6 : Détermination d’une zone de stérilisation détruisant les spores d’une souche de
Bacillus thermoacidurans et moins de 10% de la thiamine du milieu de culture.

Le D dépend du :
1- Type et l’état physiologique du micro-organisme. Pour les bactéries non sporulées, les levures
et les moisissures en général, on exprime le plus souvent D à la température de 65°C (en générale
inférieur à 30s) à l’exception des bactéries thermophiles.
2- La composition du milieu de culture n’influence que modérément les valeurs de D. Celles-ci
d’abaissent en général de part et d’autre de la neutralité. Une augmentation de la pression
osmotique ou une diminution de l’activité de l’eau peut augmenter fortement la valeur de D. La
présence de matières grasses augmente en général fortement la valeur de D (augmentation de la
solubilité de l’eau dans la matière gras).

Les procédés de fermentation peuvent, en effet, être classés au point de vue des impératifs de
stérilité, en deux groupes :
1° ceux dans lesquels la pénétration d’une microflore étrangère dans le milieu ne présente pas
trop d’inconvénients (production d’acides organiques, solvants organiques, levures, stéroïdes
et nucléotides).
2° ceux exigeant le maintien de conditions strictement aseptiques (production d’antibiotiques,
vitamines B12, vitamine B2 et cellules animales).

Remarque  :
* Pasteurilisation : D calculer à la température de 65°C ou 70°C et Z = 7 à 10 °C.
* Stérilisation : D calculer à la température de 121°C et Z = 10 °C.
Exercice :
La courbe de stérilisation d’un fermenteur pilote de 200 l est la suivante :

temps (mn) 0 10 23 33 36 40 44 47 50 55 60 65
température (°C) 30 70 104 118 120 120 107 88 58 34 29 27

Le milieu a les propriétés de l’eau, la cinétique d’inactivation des micro-organismes est celle de
Bacillus stearothermophilus FS1518. Le nombre initial de micro-organismes est de 5.10 7
spores/ml.
- Quelle est la valeur du nombre de micro-organismes après ce cycle de stérilisation ?
Commentaires. Données : K en mn-1 (121 °C) = 0,77 ; D en mn (121 °C) = 3.