Version date: 2012, 8th March

Protocole dosage des nutriments pour les

rivières wallonnes (projet WARI)

Chemical Oceanography Unit

Initial recommendations:

1) For NH4, NO3, NO2, SRP and Si analysis, two acid-cleaned stoppered bottles with
at least 50 ml each of filtered water are kept in the freezer (-20°C) until analysis.
2) For TP and TN analysis, one stoppered bottles with at least 30 ml each of
unfiltered water are kept in the freezer (-20°C) until analysis.
3) Before analysis, unfreeze only one bottle of filtered and/or unfiltered water and
keep the other one in the freezer for subsequent analysis if required.

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 Version date: 2012, 8th March

1. SOLUBLE REACTIVE PHOSPHORUS – SRP (PO43-)

A partir de l’eau filtrée !

PRINCIPE DE LA METHODE

En milieu acide et en présence de molybdate d’ammonium, les orthophosphates donnent

un complexe phoshomolybdique qui, réduit par l’acide ascorbique, développe une
coloration bleue susceptible d’un dosage spectrophotométrique. Certaines formes
organiques peuvent être hydrolysées au cours de l’établissement de la coloration et
donner des orthophosphates, le développement de la coloration est accélérée par
l’utilisation d’un catalyseur, le tartrate double d’antimoine et de potassium.

REACTIFS
Solution de Préparation
réactifs
R1 = H2SO4 5N Diluer 70 ml d’acide sulfurique H2SO4 98% (36 N) dans 430 ml d’eau
milliQ (volume final = 500 ml).
R2 Dissoudre 1.3715 g de K(SbO)C4H4O6.½H2O dans 500 ml d’eau
milliQ volume final. Garder la solution au froid (4°C) dans une
bouteille en verre.
R3 Dissoudre 20 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O dans 500 ml d’eau milliQ
volume final. Garder la solution au froid (4°C) dans une bouteille en
verre.
R4 Dissoudre 1.76 g d’acide ascorbique dans 100 ml d’eau milliQ
volume final. Cette solution ne peut pas être conservée.
Mix Mélanger les 4 solutions de réactifs dans les proportions suivantes : 50
% R1, 5 % R2, 15 % R3 and 30 % R4.
Attendre que chaque solution ait atteint la température de la pièce
avant de les mélanger. Ajouter chaque réactif dans l’ordre indiqué and
mélanger après chaque ajout. La solution de mix est stable au moins 2
semaines lorsqu’elle est gardée à 4°C.

SOLUTIONS STANDARD

Solution-mère phosphate à 1000 mg PO4/L

Cette solution commerciale est gardée au frigo.

Solution-fille phosphate à 2500 µg PO4/L (= 26.3 µM)

Diluer 400x la solution-mère : par exemple, ajouter 1.25 ml de la solution-mère dans un
ballon jaugé de 500 ml et ajouter de l’eau milliQ jusqu’au trait.

Pour préparer les différents points de la droite de calibration, diluer la solution standard
(fille) à 2500μgPO4/L dans les proportions suivantes:

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 Version date: 2012, 8th March

Pour une lecture dans une cuvette de 5 cm de parcours optique :

Standard μgPO4/L Vol. 2500μgPO4/L Vol. eau Volume
(ml) milliQ (ml) total (ml)
St 0 0 0 10 10
St 1 100 0.4 9.6 10
St 2 200 0.8 9.2 10
St 3 300 1.2 8.8 10
St 4 400 1.6 8.4 10
St 5 500 2 8 10

Pour une lecture dans une cuvette de 1 cm de parcours optique :

Standard μgPO4/L Vol. 2500μgPO4/L Vol. eau Volume
(ml) milliQ (ml) total (ml)
St 0 0 0 2 2
St 5 500 0.4 1.6 2
St 6 1000 0.8 1.2 2
St 7 1500 1.2 0.8 2
St 8 2000 1.6 0.4 2
St 9 2500 2 0 2

PROCEDURE

Allumer le spectrophotomètre au moins 30 min avant de procéder aux mesures.

Par défaut, faire une première lecture des échantillons dans une cuvette de 5 cm :

1. Dans 10 ml d’échantillons ou de solutions standards, ajouter 1.6 ml de la solution

de coloration mix.
2. Attendre 30 min (mais pas plus de 60 min)
3. Régler la longueur d’onde de mesure du spectrophotomètre à 880 nm.
4. Ajouter de l’eau milliQ dans une cuvette de 5 cm de parcours optique et régler la
mesure d’absorbance à 0.
5. Mesurer l’absorbance des échantillons et des solutions standards dans une cuvette
de 5 cm.

Si l’absorbance de l’échantillon est supérieure à l’absorbance du standard à 500 µg

PO4/L, retraiter l’échantillon pour une coloration dans une cuvette de 1 cm (2 ml
échantillon + 320 µl mix). Mesurer également dans une cuvette de 1 cm l’absorbance des
standards de la gamme allant de 0 à 2500 µg PO4/L.

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 Version date: 2012, 8th March

2. ION AMMONIUM (NH4)

A partir de l’eau filtrée !

PRINCIPE DE LA METHODE

Les ions ammonium réagissent avec les ions hypochlorites, issus de l'hydrolyse alcaline
du dichloroisocyanurate, et avec le salicylate de sodium (pH = 12,6) en présence du
nitroprussiate de sodium, qui agit comme catalyseur, pour former un composé coloré. La
coloration est bleue mais apparaît verte, suite à la couleur jaune du réactif. L'absorbance
est mesurée au spectrophotomètre à 655 nm.

REACTIFS

- R1 : salicylate :
 C7H5NaO3 (salicylate de sodium)......................................13 g
 C6H5Na3O7.2H2O (citrate trissodique)...............................13 g
 Na2[Fe(CN)5NO].H2O (nitroprussiate de Na).................0,1 g
 Eau milliQ.....................................................................100 ml

- R2 : dichloroisocyanurate de sodium :
 NaOH...............................................................................3,2 g
 Eau mQ.........................................................................100 ml
 Dissoudre et laisser refroidir.
 C3Cl2N3NaO3.2H2O (dichloroisocyanurate de Na)..........0,1 g

SOLUTIONS STANDARD

Solution-mère ammonium à 1000 mg NH4/L

Cette solution commerciale est gardée au frigo.

Solution-fille ammonium à 3 mg NH4/L (= 167 µM)

Diluer 333x la solution-mère : par exemple, ajouter 0.75 ml de la solution-mère dans un
ballon jaugé de 250 ml et ajouter de l’eau milliQ jusqu’au trait.

Pour préparer les différents points de la droite de calibration, diluer la solution standard
(fille) à 3 mgNH4/L dans les proportions suivantes:

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 Version date: 2012, 8th March

Pour une lecture dans une cuvette de 5 cm de parcours optique :

Standard mgNH4/L Vol. 3mgNH4/L Vol. eau milliQ Total
(ml) (ml) volume (ml)
St 0 0 0 10 10
St 1 0.15 0.5 9.5 10
St 2 0.30 1 9 10
St 3 0.45 1.5 8.5 10
St 4 0.60 2 8 10

Pour une lecture dans une cuvette de 1 cm de parcours optique :

Standard mgNH4/L Vol. 3mgNH4/L Vol. eau milliQ Total
(ml) (ml) volume (ml)
St 0 0 0 2 2
St 5 0.75 0.5 1.5 2
St 6 1.50 1 1 2
St 7 2.25 1.5 0.5 2
St 8 3.00 2 0 2

PROCEDURE

Allumer le spectrophotomètre au moins 30 min avant de procéder aux mesures.

Lire les échantillons de l’Ourthe, de la Meuse et du Rau de Colonster dans une

cuvette de 5 cm :

1. Dans 10 ml d’échantillons ou de solutions standards, ajouter 0.8 ml de la solution

R1, mélanger, ajouter 0.8 ml de la solution R2, mélanger.
2. Attendre 20-25 min.
3. Régler la longueur d’onde de mesure du spectrophotomètre à 655 nm.
4. Ajouter de l’eau milliQ dans une cuvette de 5 cm de parcours optique et régler la
mesure d’absorbance à 0.
5. Mesurer l’absorbance des échantillons et des solutions standards dans une cuvette
de 5 cm.

Note: Si l’absorbance de l’échantillon est supérieure à l’absorbance du standard à

0.6 mgNH4/L, réaliser une lecture dans une cuvette de 1 cm (y compris les
standards).

Lire les échantillons du Geer dans une cuvette de 1 cm :

2 ml échantillon + 160 µl R1 + 160 µl R2

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 Version date: 2012, 8th March

3. NITRITE (NO2)

A partir de l’eau filtrée !

PRINCIPE DE LA METHODE

La diazotation de la sulfanilamide par les nitrites en milieu acide et sa copulation avec le

dichlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2 éthane donne un complexe coloré pourpre
susceptible d'un dosage colorimétrique.

REACTIFS

R1: réactif de coloration:

 Eau mQ 450 ml
 Acide phosphorique 85 % 50 ml
 Sulfanilamide 5g
 dichlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2 éthane 0.5 g

Après dissolution de la sufanilamide, ajouter le dichlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2

éthane et stocker dans une bouteille brune à l'obscurité (stable au minimum 1 mois au
réfrigérateur).

SOLUTIONS STANDARD

Solution-mère nitrites à 1000 mg NO2/L

Cette solution commerciale est gardée au frigo.

Solution-fille nitrites à 500 µg NO2/L (= 10.9 µM)

Diluer 2000 x la solution-mère : par exemple, ajouter 250 µl de la solution-mère dans un
ballon jaugé de 500 ml et ajouter de l’eau milliQ jusqu’au trait.

Solution-fille nitrites à 2500 µg NO2/L(= 54.3 µM)

Diluer 400 x la solution-mère : par exemple, ajouter 1.25 ml de la solution-mère dans un
ballon jaugé de 500 ml et ajouter de l’eau milliQ jusqu’au trait.

Pour préparer les différents points de la droite de calibration, diluer la solution standard
(fille) à partir des 2 solutions filles (500 µgNO2/L ou 2500 µg NO2/L) dans les
proportions suivantes:

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 Version date: 2012, 8th March

Pour une lecture dans une cuvette de 5 cm de parcours optique :

Standard µgNO2/L Vol. 0.5 mgNO2/L Vol. eau milliQ Volume total
(ml) (ml) (ml)
St 0 0 0 10 10
St 1 25 0.5 9.5 10
St 2 50 1 9 10
St 3 100 2 8 10
St 4 250 5 5 10
St 5 500 10 0 10

Pour une lecture dans une cuvette de 1 cm de parcours optique :

Standard mgNO2/L Vol. 2.5 mgNO2/L Vol. eau milliQ Volume total
(ml) (ml) (ml)
St 0 0 0 2 2
St 1 0.5 0.4 1.6 2
St 2 1 0.8 1.2 2
St 3 1.5 1.2 0.8 2
St 4 2 1.6 0.4 2
St 5 2.5 2 0 2

PROCEDURE

Allumer le spectrophotomètre au moins 30 min avant de procéder aux mesures.

Par défaut, faire une première lecture des échantillons dans une cuvette de 5 cm :

1. Dans 10 ml d’échantillons ou de solutions standards, ajouter 750 µl du réactif de

coloration R1, mélanger.
2. Attendre 10 min à l’obscurité.
3. Régler la longueur d’onde de mesure du spectrophotomètre à 540 nm.
4. Ajouter de l’eau milliQ dans une cuvette de 5 cm de parcours optique et régler la
mesure d’absorbance à 0.
5. Mesurer l’absorbance des échantillons et des solutions standards dans une cuvette
de 5 cm.

Si l’absorbance de l’échantillon est supérieure à l’absorbance du standard à 500 µg

NO2/L, retraiter l’échantillon pour une coloration dans une cuvette de 1 cm (2 ml
échantillon + 150 µl R1). Mesurer également dans une cuvette de 1 cm l’absorbance des
standards de la gamme allant de 0 à 2500 µg NO2/L.

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 Version date: 2012, 8th March

4. NITRATE (NO3-)

A partir de l’eau filtrée !

PRINCIPE DE LA METHODE

Les nitrates sont réduits, par agitation sur du cadmium spongieux, en nitrites qui sont
dosés colorimétriquement.

REACTIFS

R1: réactif de coloration:

 Eau mQ 450 ml
 Acide phosphorique 85 % 50 ml
 Sulfanilamide 5g
 dichlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2 éthane 0.5 g

Après dissolution de la sufanilamide, ajouter le dichlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2

éthane et stocker dans une bouteille brune à l'obscurité (stable au minimum 1 mois au
réfrigérateur).

R2: solution tampon de chlorure d'ammonium 0.7 M, pH=8.5

 NH4Cl 37.4 g
 Eau mQ 900 ml
 NH4OH d=0.88 ajustement du pH

Après dissolution ajuster le pH à 8.5 par l'ammoniaque, puis compléter à 1000ml.

R3: cadmium de granulométrie 0.3-1.5 mm

Nettoyer le Cd à l'acide chlorhydrique 6 N; rincer abondamment une dizaine de fois à

l'eau milliQ, conserver le Cd sous eau jusqu’à utilisation. Le Cd utilisé pourra être à
nouveau réemployé à la suite de ces opérations de nettoyage et de rinçage.

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 Version date: 2012, 8th March

SOLUTIONS STANDARD

Solution-mère nitrates à 1000 mg NO3/L

Cette solution commerciale est gardée au frigo.

Solution-fille nitrates à 40 mg NO3/L (= 645 µM)

Diluer 25 x la solution-mère : par exemple, ajouter 10 ml de la solution-mère dans un
ballon jaugé de 250 ml et ajouter de l’eau milliQ jusqu’au trait.

Pour préparer les différents points de la droite de calibration, diluer la solution standard
(fille) à 4 mg NO3/L dans les proportions suivantes:

Standard mgNO3/L Vol. 40 mgNO3/L Vol. distilled Volume total

(ml) water (ml) (ml)
St 0 0 0 10 10
St 1 4 1 9 10
St 2 8 2 8 10
St 3 12 3 7 10
St 4 16 4 6 10
St 5 20 5 5 10
St 6 30 7.5 2.5 10
St 7 40 10 0 10

TESTER UNE FOIS UN STANDARD A 100 MG NO3/L

PROCEDURE

Etape de réduction

Dans un tube de 10 ml à bouchon vissé, introduire successivement :

 Eau milliQ 4.5 ml

 R2 (NH4Cl, 0.7M, pH=8.5) 1 ml
 R3 (Cd spongieux) environ 2 g
 Echantillon ou standard 0.5 ml

Boucher les tubes, répartir le Cd sur la tranche, et placer les en position horizontale sur la
table agitante (100 excursions/min). Agiter 120 min.

Ce protocole convient à des échantillons dont la teneur en nitrate n’excède pas 5mg N-
NO3/L. Ppour des concentrations plus importantes, il conviendra d’adapter le protocole
en diluant au préalable l’échantillon (ou prise d’essai plus petite) ou au contraire pour de

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 Version date: 2012, 8th March

faibles concentrations, il sera judicieux de réduire la dilution...Il faudra alors tenir compte
de ces « dilutions ou concentration » lors des calculs.

Etape de coloration

Directement dans des cellules plastiques pour spectrophotométrie de 1 cm de parcours

optique, introduire les volumes suivants:

 Eau milliQ 1 ml
 Echantillon ou standard réduit 1 ml
 R1 150 µl

Agiter, incuber 10 min (faible lumière) et procéder aux mesures de l'absorbance à 540 nm
(coloration stable 2h). Pour l'expression des résultats des échantillons, se rapporter à la
droite d'étalonnage qui donne directement la teneur en NO 3+NO2 en mg NO3/L. La teneur
en azote nitrique est obtenue par différence entre l'azote ainsi déterminé et l'azote nitreux.

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