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Travaux Pratiques de chimie océanographique

Mastere Océanographie

T. MOUTIN-B. BEKER
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T.P. n° 1. DOSAGE DE L'OXYGENE DISSOUS (Méthode de Winkler)

Mesure de la salinité et détermination de la masse volumique à partir de
l’équation internationale d’état de l’eau de mer de 1980

T.P. n° 2. DOSAGE DE SELS NUTRITIFS DANS L'EAU DE MER

1.1. DOSAGE DE L'AZOTE AMMONIACAL

1.2. DOSAGE DES ORTHOPHOSPHATES

T.P. n° 3. DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE a (comparaison des résultats

obtenus par deux méthodes de dosage après extraction et validité de la
mesure fluorométrique in vivo)

T.P. n° 4. MESURE DU pH, DE L'ALCALINITE TOTALE ET DE LA TENEUR

EN CALCIUM D'UNE EAU DE MER. DETERMINATION DE L’ENSEMBLE
DES VARIABLES DU SYSTEME CARBONATE.

T.P. n° 5. DOSAGE DE L'AZOTE ORGANIQUE DISSOUS ET

PARTICULAIRE SUR AUTOANALYSEUR APRES MINERALISATION A
L’AUTOCLAVE
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T.P. n° 1.
DOSAGE DE L'OXYGENE DISSOUS (Méthode de Winkler)
Mesure de la salinité et détermination de la masse volumique à partir de
l’équation internationale d’état de l’eau de mer de 1980

I INTRODUCTION

Les teneurs en oxygène dissous dans l'eau de mer sont la résultante de flux de production
(diffusion de l'oxygène atmosphérique, photosynthèse) et de flux de consommation
(respiration, dégradation de matières organiques). Les valeurs peuvent varier entre 0 et 8
ml.l-1.
Il existe de nombreuses méthodes pour déterminer l'oxygène dissous dans l'eau de mer
(chimique, électrochimique, chromatographie en phase gazeuse). Même si la méthode
électrochimique est intéressante car plus facile à mettre en oeuvre "in situ", la méthode la
plus précise est la méthode de Winkler. Nous utiliserons cette méthode, légèrement
modifiée par Carpenter (1965) et Carritt & Carpenter (1966), qui est considérée comme la
référence universelle.

II PRINCIPE DU DOSAGE

Le principe du dosage est de former un précipité de manganèse (Mn II) et de l'oxyder par
l'oxygène dissous (Mn III et Mn IV). En milieu acide et en présence d'iodure, le manganèse
est réduit, ce qui libère de l'iode. L'iode est alors titré par le thiosulfate.

Les réactions intervenant dans le dosage sont :

(1) Formation du précipité de Mn (II) par la soude

Mn2+ + 2 OH- ----> Mn(OH)2

(2) Oxydation du Mn (II) par l'oxygène.

(a) Mn(OH)2 + 1/4 O2 + 1/2 H2O ----> Mn(OH)3
(b) Mn(OH)2 + 1/2 O2 + H2O ----> Mn(OH)4

(3) Réduction du Manganèse par l'iodure en milieu acide

(a) Mn(OH)3 + I- + 3 H+ ----> Mn2+ + 3 H2O + 1/2 I2
(b) Mn(OH)4 + 2 I- + 4 H+ ----> Mn2+ + 4 H2O + I2
donc 1 mole d'oxygène (O2) libère 2 moles d'iode (I2)
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(4) Dosage de l'iode par le thiosulfate

2 S2032- + I2 ----> S4O62- + 2 I-

Finalement, à 1 mole de thiosulfate correspond 1/4 mole d'oxygène.

Le point équivalent du dosage peut être mis en évidence par plusieurs méthodes. Nous
utiliserons un indicateur coloré d'oxydo-réduction, l'amidon.

III MODALITES DU DOSAGE

III-1 Domaine d'application, précision.

Domaine d'application : 0,005-8,000 mM équivalent à 0,06-90 ml.l-1 d'oxygène.

Précision : pour C = 0,7 mM, ∆C = 0,003/n1/2 mM (précision maximum obtenue pour un
laboratoire à terre dans les conditions idéales, n : nombre de réplicats, seuil de confiance
95%). C'est-à-dire que pour une mesure dans la gamme habituelle des concentrations, la
précision est de ± 0,035 ml.l-1 (précision maximum obtenue dans des conditions de travail
idéales).

Remarque : dans toute la manipulation, la précaution essentielle consiste à ne pas

introduire d'oxygène dans l'échantillon. Il faut donc éviter toute introduction de bulles
d'air. Les principales sources d'erreurs inhérentes au dosage se résument en 5 points :
-oxydation de l'iodure à l'air
-volatilisation de l'iode
-adjonction d'oxygène par les réactifs
-consommation ou production d'iode par les impuretés des réactifs
-différence entre le point équivalent réel et le point de fin de titrage
La méthode n'est pas applicable dans les eaux contenant beaucoup de matières en
suspension ou des substances organiques oxydables en milieu fortement basique ou
susceptible de réagir avec l'iode en milieu acide.

Remarque : la précision est déterminée en supposant qu'il n'y a pas d'erreur systématique;
la valeur moyenne est la valeur vraie.
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III-2 Echantillonnage

L'échantillon prélevé est transféré immédiatement de la bouteille dans un flacon à

l'aide d'un tube souple. Plonger le tube jusqu'au fond du flacon et le remplir sans
introduire de bulles d'air en laissant déborder un volume équivalent au volume du
flacon. Retirer le tube lentement en arrêtant l'écoulement juste avant que son
extrémité ne vienne à l'air.

Remplissage du flacon d'échantillonnage, à partir de la bouteille de prélèvement, pour l'analyse de

l'oxygène dissous : le tuyau pénétrant jusqu'au fond du flacon et le contrôle de débit par la pince
permettant d'éviter tout barbotage (Aminot & Chaussepied, 1983).

Ajouter immédiatement 1 ml de réactif 1 et 1 ml de réactif 2.

Boucher sans introduire de bulles d'air (attention : à un flacon correspond un bouchon).
Agiter, laisser reposer, agiter de nouveau.
Laisser reposer à l'abri de la lumière au moins jusqu'à ce que le précipité n'occupe plus
que le tiers inférieur du volume du flacon et que la température du flacon soit égale à celle
du laboratoire.

Remarque : cette opération peut être menée à bord d'un navire. La suite des opérations
peut être poursuivie plus tard. Dans ce cas, il est recommandé de maintenir les flacons en
immersion.
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III-3 Réactifs

Réactif 1 : solution de manganèse 3M#

Dissoudre 600 g de MnCl2 ou 670 g de MnSO4,4H2O ou 560 g de MnSO4,2H2O ou 510 g
de MnSO4,H2O dans de l'eau déionisée, compléter à 1 l.

Réactif 2 : solution de KI (4M) et NaOH (8M)#

Dissoudre 320 g de NaOH dans 400 ml d'eau déionisée. Dissoudre, en chauffant si
nécessaire, 600 g de NaI dans 300 ml d'eau déionisée en agitant continuellement. Mélanger
les deux solutions lorsqu'elles sont froides et compléter à 1 l.

Solution de thiosulfate de sodium 0,01 M

A préparer à partir de thiosulfate de sodium Na2S2O3,5H2O

Solution d'iodate de potassium 0,0017 M#

Dissoudre 0,3567 g de KIO3 (séché à 105° pendant 1 heure) dans 300 ml d'eau déionisée.
Chauffer légèrement pour dissoudre. Laisser refroidir. Compléter à 1 l.
Cette solution est stable indéfiniment à condition de l'agiter avant l'utilisation et de
reboucher le flacon immédiatement après.

Amidon 1%#
Dissoudre 1 g d'amidon soluble dans 100 ml d'eau déionisée en chauffant jusqu'à ce que la
solution devienne claire ; ajouter quelques gouttes de chloroforme et conserver au
réfrigérateur. Elle se conserve plusieurs mois.
La solution d'amidon est à jeter quand la couleur du virage évolue vers le vert ou le brun
ou si un trouble s'y développe.

Acide sulfurique concentré (5 M)#

Diluer 280 ml d'acide sulfurique concentré (d=1,84) à 1 l d'eau déionisée.

III-4 Titrage

Etant donné les risques de perte d'iode par transvasage et pipettage, le titrage doit se faire
directement dans le flacon de prélèvement ; On utilise pour cela des flacons spéciaux avec
des bouchons "plongeurs". Le volume exact d'échantillon servant au dosage doit être
connu avec précision (attention à bien utiliser le flacon et le bouchon correspondant).
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Bouchon plongeur permettant d'évacuer un certain volume d'eau du flacon afin de permettre
l'addition du titrant dans le flacon lui-même (Aminot & Chaussepied, 1983).

Ouvrir délicatement le flacon. Introduire 2 ml d'acide sulfurique concentré. Reboucher

(sans introduire de bulles) et agiter jusqu'à dissolution du précipité. Doser
immédiatement.

Effectuer le dosage en respectant les règles suivantes :

-Titrer en agitant lentement, pour homogénéiser, jusqu'à décoloration presque totale
(jaune pâle),
-ajouter quelques gouttes de solution d'amidon,
-terminer le titrage au goutte à goutte avec une agitation plus rapide, jusqu'à décoloration
complète persistant 20 secondes. Procéder rapidement mais en attendant
l'homogénéisation de la solution après chaque ajout. Ne pas tenir compte de toute
recoloration lente se produisant après le point équivalent (oxydation de I- à l'air).

Soit Ve, le volume de thiosulfate utilisé pour doser l'échantillon.

III-5 Détermination du blanc et étalonnage du thiosulfate

Remplir un erlen avec environ 100 ml d'eau déionisée. Ajouter 2 ml d'acide sulfurique
concentré, puis 1 ml de réactif 2 (solution de KI,NaOH) et agiter. Ajouter 1 ml de réactif 1
et agiter de nouveau.
La solution est prête pour la détermination du blanc puis l'étalonnage du thiosulfate.
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Détermination du blanc :

Ajouter l'amidon.
-si la solution bleuit, doser par le thiosulfate 0,01 M jusqu'à décoloration : soit Vb ce
volume.
-si la solution reste incolore, doser par la solution de KIO3 0,0017 M à l'aide d'une
pipette graduée jusqu'à coloration bleue; si Vb' est ce volume, le blanc sera Vb = -Vb'.
Si la coloration apparaît dès la première goutte de KIO3 versée, Vb = 0.

Etalonnage du thiosulfate : à réaliser chaque jour.

Ajouter précisément 10 ml de la solution étalon de KIO3 0,0017 M à la solution précédente.

Laisser la réaction se poursuivre à l'obscurité entre 2 et 5 mn. Titrer par le thiosulfate. Soit
Vs le volume versé. La molarité de la solution de thiosulfate est :

M = (6Mivi)/Vs

M : titre du thiosulfate
Mi : titre de l'iodate utilisé pour la standardisation (0,0017 M)
vi : volume d'iodate utilisé pour la standardisation
Vs : volume de thiosulfate utilisé pour la standardisation
Vb : volume du blanc.

Remarque : le dosage de l'iodate par le thiosulfate a lieu selon la réaction suivante :

6S2O32- + IO3- + 6H3O+ ------> 3S4O62- + I- + 9H2O

III-6 Expression des résultats :

Soit Ve, le volume de thiosulfate (ml) utilisé pour doser un échantillon.

Le nombre de moles de thiosulfate utilisé pour doser un échantillon est :
M(Ve - Vb)/1000.
D'après les réactions ci-dessus, à 1 mole de thiosulfate correspond 1/4 mole d'oxygène,
soit 22400/4=5600 ml d'oxygène dans les conditions normales de température et de
pression.
Le nombre de ml d'oxygène que contient l'échantillon est donc 5600*M(Ve - Vb)/1000
c'est-à-dire une concentration de :
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[O2] (ml.l-1) = 5,6*M(Ve - Vb) * 1000/Vt * Vf/(Vf-v)

avec Vt : volume sur lequel est fait le titrage (dans notre cas Vt = Vf),
Vf : volume d'eau de mer prélevée (volume du flacon),
v : volume des réactifs 1 et 2,
Vf/(Vf - v) est pour tenir compte de la dilution provoquée par l'addition des
réactifs 1 et 2. L'addition ultérieure d'acide ne produit pas de dilution car il
remplace un volume équivalent d'eau exempte d'oxygène.

IV MANIPULATION

La manipulation consiste à doser l'oxygène dissous d'une eau de mer (faire au minimum 3
réplicats).
Préparer la solution de thiosulfate 0,01 M. Réaliser trois fois la détermination du blanc et
l'étalonnage du thiosulfate. Prélever les échantillons à la bouteille Niskin en prenant les
précautions nécessaires indiquées en III-2 et effectuer les dosages.
Exprimer les résultats en ml.l-1 et en µmol.kg-1 d'eau de mer. Calculer les intervalles de
confiance.
Calculer l'écart par rapport à la saturation d'oxygène.
En fin de manipulation, laver soigneusement les flacons à l'eau déionisée. Veiller à ce qu'il
ne reste pas de trace de Mn (II).

Mesure de la salinité et détermination de la masse volumique

Introduction :

La salinité est une variable très importante en océanographie. La plupart des propriétés
physiques de l’eau de mer dépendent de sa température et de sa salinité. Le caractère
conservatif de ces deux variables a conduit les océanographes à considérer comme
principal outil dans l’étude de la formation des masses d’eau, de leur mélange et de leur
circulation, le diagramme température-salinité.

Définition de la salinité :

La notion de salinité a évoluée au cours du temps. La définition actuelle est dans le

rapport UNESCO n° 36 « l’échelle de salinité pratique de 1978 et l’équation internationale
d’état de l’eau de mer de 1980 » disponible en salle de travaux pratiques. La méthode de
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mesure de la salinité repose sur la mesure d’un rapport de conductivité, la salinité
(nouvelle définition) est donc une variable adimensionnelle.

Manipulation :

Dés que les prélèvements pour l’oxygène ont été réalisés, prélever de l’eau à la bouteille
Niskin dans le flacon prévu pour la mesure de la salinité. Laisser le flacon sur la paillasse
le temps nécessaire pour que sa température soit égale à la température de l’eau normale
(K15 = 1).
Mesurer la température : t
Mesurer la conductivité de votre échantillon (condéch (t, p=0)) et la conductivité de l’eau
normale (condEN (t, p=0)) en faisant bien attention de bien rincer et sécher l’électrode entre
chaque mesure.
Cond é ch (t, p = 0)
Calculer Rt : Rt =
Cond EN (t, p = 0)

Consulter les tables océanographiques internationales disponibles en salle de travaux

pratiques pour déterminer :
-Suncorrected à partir de Rt
-∆S à partir de t et Rt
Calculer S : S = Suncorrected + ∆S

A partir de S et de tin situ, déterminer la masse volumique (ρ(S,t,p=0)) de votre eau de mer
en utilisant le programme eqetat.xls dans le répertoire C/etudiants/maitrise/TPchimie
sur le microordinateur de la salle de travaux pratiques. Vous avez également la possibilité
de lire directement la valeur de ρ sur le tableau présenté en annexe.
Pensez à afficher au tableau vos résultats qui intéressent l’ensemble des étudiants (tin situ, S,
ρ).
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Annexes :

Solubilité de l'oxygène dans l'eau en fonction de la température et de la salinité. Les valeurs sont en ml.l-1
(Aminot & Chaussepied, 1983)
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Valeur de la masse volumique (g.cm-3) en fonction de la température (°C) et de la salinité

(Millero & Poisson, 1981)
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T.P. n° 2.
DOSAGE DE SELS NUTRITIFS DANS L'EAU DE MER

1.1. DOSAGE DE L'AZOTE AMMONIACAL

I INTRODUCTION

L'azote minéral dissous dans l'eau de mer existe sous forme d'azote gazeux et d'ions
ammonium, nitrite et nitrate. L'azote ammoniacal est sous forme d'ions ammonium
(NH4+) dans la gamme de pH des eaux marines. Ils occupent une place particulière dans
le cycle de l'azote. Ils sont assimilés par les végétaux aquatiques comme les ions nitrates et
participent donc à la production de matière organique. Par ailleurs, la dégradation de
l'azote organique particulaire ou dissous donne lieu à la formation d'azote ammoniacal
(qui peut s'oxyder ensuite en nitrite puis nitrate). Ils participent donc à l'activité
autotrophe et à l'activité hétérotrophe. Enfin, le zooplancton contribue à enrichir l'eau de
mer en azote ammoniacal par excrétion directe.
Les teneurs en ions ammonium dans l'eau de mer sont généralement comprises entre 0 et
3 µM.

II PRINCIPE DU DOSAGE

Le dosage est basé sur la réaction signalée par Berthelot (1859). En milieu alcalin,
l'ammoniac dissous réagit avec l'hypochlorite pour former une monochloramine. Ce
composé, en présence de phénol et en milieu oxydant (excès d'hypochlorite), donne lieu à
la formation d'un complexe coloré en bleu (le bleu d'indophénol) que l'on peut doser par
spectrophotométrie. A 20°C, la réaction demande 6 h pour se développer. L'absorption est
mesurée à 630 nm.
La méthode a été appliquée à l'eau de mer, en particulier par Solorzano (1969) et par
Koroleff (1969). La précipitation du calcium et du magnésium en milieu basique est évitée
par complexation avec le citrate trisodique.
Les interférences dues à l'azote organique dissous dans l'eau de mer (sous forme d'urée,
d'acides aminés et d'acides nucléiques) sont négligeables. La méthode est en défaut dans
les eaux anoxiques si la concentration en sulfure est supérieure à 2 ppm.
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III MODALITES DU DOSAGE

La difficulté principale du dosage réside dans le risque permanent de pollution

(atmosphère polluée au laboratoire, fumée de tabac,...).

III-1 Limites d'emploi

0,1-100 µM
La loi de Beer-Lambert est observée entre 0 et 10 µM.
Précision : pour C = 3 µM, ∆C = 0,07/n1/2 µM (n : nombre de réplicats, cuve de 10 cm,
seuil de confiance 95%)

III-2 Echantillonnage

Les échantillons doivent être recueillis directement après le prélèvement avec le maximum
de précaution. Faire attention à la contamination atmosphérique (interdiction de fumer). Il
est préférable de doser les échantillons immédiatement.

III-3 Réactifs

Il est recommandé d'utiliser de l'eau distillée, redistillée en milieu acide et oxydant.

Réactif 1 : solution de phénol-nitroprussiate#

Dissoudre 17,5 g de phénol (C6H5OH) et 200 mg de nitroprussiate de sodium
(Na2(Fe(CN)5NO),2H2O) dans 400 ml d'eau déionisée (milli-Q). Compléter jusqu'à 500 ml.
Ce réactif se conserve plusieurs semaines au froid et à l'abri de la lumière.

Réactif 2 : solution alcaline d'hypochlorite#

Dissoudre 140 g d'acide trisodique (C6H5Na3O7,2H2O), et 11g de soude dans 400 ml d'eau
déionisée (milli-Q). Ajouter la quantité d'hypochlorite nécessaire pour réaliser une
solution contenant 0,14 % de chlore . Compléter à 500 ml.
Cette solution est stable si elle est conservée au froid et à l'abri de la lumière.
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Préparation de la solution à 0,14 % de chlore# :

Cette solution est préparée à partir d'une solution commerciale d'hypochlorite de sodium
PROLABO à 10° chlorométrique, soit à 3,04% de chlore par litre quand elle est fraîche. Le titre de
la solution commerciale peut être contrôle de la manière suivante :
A 1 ml de la solution commerciale, on ajoute 50 ml de KI à 1% et 0,25 ml de HCl concentré. L'iode
libéré est titré par une solution de thiosulfate 0,1 M. A 1 ml de thiosulfate 0,1M correspond 3,54
mg de chlore.

III-4 Mode opératoire

Dosage

A 100 ml d'échantillon, ainsi que pour les solutions standards et les blancs (Attention :
l’ajout des réactifs s’effectue dans les flacons à bouchons noirs ou le volume de 100 ml a
été repéré) :
ajouter 3 ml de réactif 1, agiter,
ajouter 3 ml de réactif 2, fermer hermétiquement, agiter et maintenir à l'obscurité.
La réaction demande 6 h au moins pour se développer à la température ambiante ( 20°C).
Il est préférable de la laisser se poursuivre une nuit. Une fois formée, la coloration est
stable plusieurs jours. Pour accélerer la réaction, il est possible de chauffer les échantillons
au bain marie pendant 30 minutes (il n'est pas nécessaire dans ce cas de maintenir les
flacons à l'obscurité). La température doit être controllée, il ne faut pas que l’eau bout.
L'absorbance est mesurée à 630 nm par rapport à de l'eau déionisée (milli-Q).

Etalonnage

Préparation de la solution mère :

Peser 66 mg de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 et les dissoudre dans 200 ml d'eau
déionisée (milli-Q). Ajouter 1 goutte de chloroforme, compléter à 1000 ml. Conservée au
réfrigérateur, cette solution est stable plusieurs mois. #

Préparation de la gamme étalon :

A partir de la solution mère, réaliser la solution fille à 5 µM puis les solutions standards à
1,2,3,4 et 5 µM avec de l'eau de mer pauvre en ammonium.
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Détermination des blancs

-Pour la gamme étalon : Le blanc est determiné avec de l'eau de mer pauvre en
ammonium. Faire le zéro du spectrophotomètre sur l'eau déionisée (milli-Q) puis
déterminer le blanc à 630 nm. Il est à déduire des valeurs d'absorbance mesurées pour les
standards.
-Pour les échantillons : Etant donné qu’il n’y a pas eu de dilution, le blanc est réalisé avec
les réactifs uniquement. L’eau de mer pauvre en ammmonium » est ajoutée uniquement
avant le passage au spectrophotomètre. Cette valeur de blanc réactif est à déduire des
absorbances mesurées pour les échantillons.

IV MANIPULATION

La manipulation consiste à réaliser le dosage de l'azote ammoniacal d'une eau de mer.

Réaliser une gamme étalon et doser les échantillons en effectuant au minimum 3 réplicats.
A la fin de la manipulation, rincer abondamment les flacons "ammonium" (c'est-à-dire
avec un bouchon noir), ajouter 100 ml d'eau déionisée (milli-Q) et 3 ml de chaque réactif et
ranger les flacons. Si une couleur apparaît, elle sera significative d'un problème de
contamination : il est donc nécessaire en début de manipulation d'avoir des flacons non
colorés.
Exprimer les résultats en µmol.kg-1, en µg.l-1 (N) et en µM.
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2.2. DOSAGE DES ORTHOPHOSPHATES

I INTRODUCTION

Le phosphate minéral dissous dans l'eau de mer est essentiellement sous forme
d'orthophosphates (H2PO4- et HPO42-). La concentration en orthophosphates dans l'eau
de mer dépend de phénomènes physiques (advection, diffusion), chimiques (précipitation,
dissolution) et biologiques (consommation, excrétion, régénération). Elle varie de moins
de 0,01 µM dans l'eau de surface (pendant la période de croissance du phytoplancton) à 3
µM en profondeur.

II PRINCIPE

La méthode utilisée pour le dosage des orthophosphates a été mise au point par Murphy
et Riley (1962). Les ions orthophosphates sont susceptibles de réagir avec le molybdate
d'ammonium en milieu acide pour former un complexe jaune, le phosphomolybdate
d'ammonium. Par réduction de ce complexe, on obtient une coloration bleue. L'utilisation
de l'acide ascorbique comme agent réducteur donne les résultats les plus reproductibles et
il a l'avantage de pouvoir être utilisé dans un réactif unique : molybdate d'ammonium,
acide ascorbique, acide sulfurique et antimonyl tartrate de potassium. L'antimoine fourni
par l'antimonyl réduit le temps de développement de la coloration de 24 h à quelques
minutes.

III MODALITES DU DOSAGE

III-1 Limite d'emploi

De 0,03 à 5 µM
Précision : 3 ± 0,03/n1/2 µM
0,3 ± 0,02/n1/2 µM
La précision est donnée pour un seuil de confiance de 0,95.

III-2 Echantillonnage

Les échantillons sont recueillis dans des flacons (bouchons blancs) rincés 2 fois avec l'eau à
analyser. La mesure doit être effectuée si possible dans la demi-heure qui suit le
prélèvement et avant 2 h sinon les échantillons doivent être congelés à -20 °C : ceci permet
de les conserver pendant plusieurs mois.
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III-3 Réactifs

1 solution d'acide ascorbique :

Dissoudre 2 g d'acide ascorbique dans 50 ml d'eau déionisée (milli-Q).

2 Solution de molybdate d'ammonium :#

Dissoudre 15 g de paramolybdate d'ammonium (NH4)6Mo7O24,4H2O dans 500 ml d'eau
déionisée (milli-Q). Conserver dans une bouteille en plastique, hors de la lumière
(solution très stable).

3 Acide sulfurique :#
Ajouter 140 ml d'acide sulfurique (d = 1,82) à 900 ml d'eau déionisée (milli-Q). Laisser
refroidir et conserver dans une bouteille en verre.

4 Solution émétique:#
Dissoudre 0,34 g d'"émétique" (antimonyl tartrate de potassium), dans 250 ml d'eau
déionisée (milli-Q) (en chauffant si nécessaire). La solution est stable plusieurs mois si elle
est conservée au frais.

Réactif combiné:#
Les solutions 2,3 et 4 sont préparées au préalable. Mélanger 50 ml de molybdate
d'ammonium, 125 d'acide sulfurique, et 25 ml d'émétique. Ce mélange est stable quelques
mois.

III-4 Mode opératoire

Dosage

A 100 ml d'échantillon, ajouter 1 ml de la solution d'acide ascorbique, mélanger puis

ajouter 4 ml du réactif combiné et agiter.
Après 30 mn et avant 2 h, mesurer l'absorbance de la solution à 700 nm par rapport à l'eau
déionisée (milli-Q).
Corriger la mesure en soustrayant le blanc des réactifs et s'il y a lieu la turbidité.
Remarque : la température des échantillons doit être comprise entre 15 et 30 °C.
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Détermination des blancs et de la turbidité

Blanc pour les solutions standards : procéder comme décrit précédemment en utilisant 100
ml d'eau déionisée (milli-Q).
Blanc pour les échantillons : ajouter l’eau milli-Q uniquement avant le passage au
spectrophotomètre.

Turbidité de l'eau de mer : cette valeur peut être importante pour les échantillons d'eau de
mer de surface jusqu'à une profondeur de 10 m. On l'évalue par mesure de l’absorbance
de l'eau de mer par rapport à l'eau déionisée (milli-Q).

Etalonnage

La salinité n'a pas d'influence sur le développement de la coloration : l'étalonnage est

effectué dans de l'eau déionisée (milli-Q).

Solution mère de phosphate# :

Dissoudre 68 mg de phosphate acide de potassium anhydre (KH2PO4) dans 1000 ml d'eau
déionisée (déionisée (milli-Q)).

Solutions pour l'étalonnage :

Préparer des solutions à 1,2,... 5 µM. Ne pas oublier de préparer un blanc simultanément.

IV MANIPULATION

La manipulation consiste à réaliser le dosage des orthophosphates d'une eau de mer.

Préparer la courbe d'étalonnage et doser l'eau en effectuant au minimum 3 réplicats.
Exprimer les résultats en µmol.kg-1, en µg.l-1 (P), en µg.l-1 (PO4), et en µM.
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T.P. n° 3.
DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE a
(comparaison des résultats obtenus par deux méthodes de dosage après
extraction et validité de la mesure fluorométrique in vivo)

I INTRODUCTION

Le dosage de la chlorophylle a, pigment indispensable à la photosynthèse, sert à estimer la

biomasse phytoplanctonique. Dans le milieu marin, la concentration varie de 0 à une
dizaine de µg.l-1. Son évolution dans les eaux superficielles est essentiellement
saisonnière; le développement phytoplanctonique est tributaire des variations de l'énergie
lumineuse, de la réserve en sels nutritifs, de la stabilité et du conditionnement des masses
d'eau et de l'intensité du broutage par le zooplancton.
La détermination simultanée de la concentration en phéopigments est nécessaire pour
parvenir à des résultats corrects. Les teneurs en phéopigments se rapportent à la fraction
dégradée des chlorophylles. En milieu non perturbé, on considère que cette dégradation
est due essentiellement à la digestion du phytoplancton par le zooplancton herbivore
(acidification dans le tube digestif et rejet dans le milieu). Dans un milieu soumis à des
pertubations diverses, les concentrations de phéophytine traduisent, outre cette
consommation, l'existence d'autre "stress" subis par les cellules, reflétant ainsi l'état
général de la population.

Il existe différentes méthodes pour estimer la biomasse phytoplanctonique à partir des

teneurs en pigments : fluorimétrie "in vivo" ou après extraction des pigments, HPLC,
spectrofluorimétrie, spectrophotométrie.
Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients. La méthode fluorimétrique
est très employée actuellement car elle présente l'avantage d'être sensible et rapide. Elle
peut être réalisée directement "in vivo". Quand les pigments absorbent de l'énergie, la plus
grande part (85 % dans les conditions optimales) est utilisée dans les processus
photochimiques, le reste est perdu sous forme radiative (chaleur, fluorescence). Cette
quantité, "perdue" pour la photosynthèse, constitue la fluorescence "in vivo" (Robert,
1983).
Nous allons comparer les résultats obtenus par trois méthodes, la fluorimétrie in vivo, la
fluorimétrie et la spectrophotométrie après extraction des pigments. Les échantillons, qui
vont servir de base de donnée pour la comparaison, correspondent à une culture de
diatomée (Phaeodactylum tricornutum) ou de chlorophycée (Dunaliela tertiolecta). Les
cultures, agées de 15 jours maximum, sont en phases exponentielle ou plateau donc la
concentration en phéophytine peut être négligée.
 -21-

II PRINCIPE DES METHODES

La mesure fluorimétrique "in vivo" consiste à mesurer directement la fluorescence de

l'échantillon. Pour les deux autres méthodes, le phytoplancton est recueilli sur un filtre
GF/F (porosité nominale = 0,7 µm) et repris par un solvant pour extraire les pigments
chlorophylliens. Nous utilisons le éthanol comme le préconise Nusch (1980).

Echantillon

Filtration

Extraction
1/2 h

Mesure fluorimétrique Mesure fluorimétrique Mesure spectrophotométrique

Pour la mesure fluorimétrique, les pigments sont excités par un faisceau lumineux à 450
nm. La fluorescence émise est mesurée à 670 nm.
Pour la spectrophotométrie, l'absorbance est mesurée à deux longueurs d'onde (665 et 750
nm).

III MODALITES DES DOSAGES

III-1 Limite d'emploi

Domaine d'application (méthode spectrophotométrique)

Gamme de concentrations : en principe, la méthode s'applique sans restrictions; seuls

l'appareillage et les possibilités de filtration limitent la gamme.

Précision : d'après Strickland et Parsons (1968), les précisions sont les suivantes (seuil de
confiance 95 %).
chlorophylle a : pour C = 5 µg l-1, ∆C = 0,26/n1/2 µg l-1
 -22-

Limite de détection : elle est difficile à définir car elle dépend du volume filtré pour
l'analyse. Dans la pratique, un prélèvement de 10 l devient généralement un maximum.
Pour un tel volume, la limite de détection se situe aux environ de 0,02 µg.l-1 pour la
chlorophylle a.
Pour la méthode fluorimétrique, on considère que la précision est de 0,01 µg chloa.l-1 pour
un échantillon d'eau de 2 litres et qu'elle est supérieure à 8 % pour des teneurs supérieures
à 0,5 µg.l-1.

III-2 Réactifs

Solution mère de chlorophylle a :#

Environ 1 mg de chlorophylle a est dissous dans 50 ml d'acétone à 90 % (10 % d'eau en
volume). Mesurer l'absorbance à 663 nm.
La concentration en chlorophylle dans la solution mère est :
[Chloa] = A663/89,1.l (g.l-1) d'après Marker (1972)

Acétone à 90 % :#
Verser 100 ml d'eau déionisée prélevée à la pipette dans une fiole jaugée de 1000 ml.
Compléter au volume avec de l'acétone. Ce réactif peut être conservé à l'obscurité dans
une bouteille bien fermée.

Ethanol 97 % :#

III-3 Filtration :

Filtrer sur un filtre en fibre de verre GF/F (porosité nominale d’environ 0,7 µm, les filtres
Whatman GF/F doivent être utilisés sous une dépression comprise entre 0 et 300 mm de
Hg). Le volume à filtrer dépend de la concentration en chlorophylle. Pour l'eau de mer, un
volume de 250 ml est préconisé. Pour les cultures cellulaires, la filtration s'effectue jusqu'à
coloration du filtre.
 -23-

Introduire le filtre, prélevé à l'aide de pinces, dans un tube à essais de 10 ml et boucher. Le

filtre peut être conservé au congélateur à -20 °C.

Remarque : cette étape est généralement réalisée sur le bateau immédiatement après le
prélèvement.

III-4 Extraction :

Introduire 10 ml de éthanol (97 %) dans le tube à essais contenant l'échantillon. Agiter.

Laisser se poursuivre l'extraction 30 minutes au réfrigérateur et à l'obscurité. Doser
immédiatement (Agiter et centrifuger si nécessaire au préalable).

III-5 Mesure fluorimétrique

Etalonnage du fluorimètre (à réaliser périodiquement) : #

Préparer des dilutions de la solution mère de chlorophylle a dans l’éthanol.

Faire le zéro du fluorimètre sur un tube témoin d’éthanol puis mesurer la fluorescence des
solutions.
Tracer la courbe d'étalonnage et déterminer le coefficient Ko (UF/µg.l-1). L'appareil
travaillant en simple faisceau, il évolue avec l'émission en fonction du temps et doit être
vérifié périodiquement.

Mesure :

Mesure "in vivo" :

Transférer l'échantillon dans la cuve de mesure. Mesurer la fluorescence Fo de
l'échantillon.

mesure après extraction :

Transférer une partie de l'extrait dans la cuve de mesure (ne pas entraîner de fibres).
Mesurer la fluorescence Fo de l'échantillon.
Suivre le même mode opératoire sur un filtre vierge pour déterminer la valeur du blanc.

Calcul des concentrations des échantillons :

Fo v
[chloa ](µg. l −1 ) =
*
Ko V
où Fo est la valeur de la fluorescence de l'échantillon (retrancher le blanc du
filtre).
 -24-

v = volume de la solution d’éthanol (ml)

V = volume d'échantillon filtré (ml)
Ko = facteur d'étalonnage

III-6 Mesure spectrophotométrique

Transférer l'autre partie du surnageant dans la cuve de mesure (ne pas entraîner de
fibres). Faire le zéro du spectrophotomètre avec de l’éthanol à 665 nm. Mesurer
l'absorbance de l'échantillon à 665 et 750 nm (Abo665 et Abo750), (cf çi-dessous).

Mesures :
Mesurer x750 : Régler la longueur d'onde à 665 nm et faire le zéro avec l’éthanol (97 %) puis
régler la longueur d'onde à 750 nm et noter l'absorbance correspondant à x750.
Ne plus refaire le zéro du spectrophotométre.
Pour chaque échantillon et un blanc réactif (effectué avec un filtre vierge), mesurer
l'absorbance à 665 nm (Abo665) et à 750 nm (Abo750).

Calcul des concentrations des échantillons :

Retrancher chaque lecture à 750 nm (blanc de "turbidité") à l'absorbance correspondante
mesurée à 665 nm (Ao665 = Abo665 - (Abo750 - x750)).
Retrancher à chaque valeur de Ao665 la valeur du blanc réactif à 665 nm (A665 = Ao665 –
blanc réactif).
Utiliser l’équation suivante pour calculer la concentration en chlorophylle a des
échantillons :
6.5 * A665 * v
[chloa ](µg.l −1 ) =
V .l
où Ao665 est l'absorbance à 665 nm, v le volume de solvant utilisé (ml), V le volume d'eau
filtrée (litre), l le trajet optique de la cuve spectrophotométrique (cm).

IV MANIPULATION

Le but de la manipulation est de comparer 3 méthodes permettant d'estimer la

concentration en chlorophylle a : la fluorimétrie "in vivo" et après extraction, et la
spectrophotométrie. Pour cela, vous disposez de huit échantillons d'une culture d'algues.
Mesurer uniquement Fo pour la méthode fuorimétrique "in vivo". Déterminer la
concentration en chlorophylle a pour les deux méthodes après extraction à l’éthanol. .
Tracer [Chloa]fluo en fonction de [Chloa]spectro. Tracer Fo"in vivo" en fonction de la
concentration en chlorophylle a. En vous inspirant des résultats obtenus par Neveux et al.
(1990), discutez vos résultats.
 -25-

Le tableau ci-dessous représente les résultats d'une comparaison des méthodes spectrophotométrique,
fluorimétrique, spectrofluorimétrique et d'HPLC (Neveux et al., 1990).
-26-
 -27-

T.P. n° 4.
MESURE DU pH, DE L'ALCALINITE TOTALE ET DE LA TENEUR EN
CALCIUM D'UNE EAU DE MER

I INTRODUCTION

L'étude du cycle biogéochimique du carbone nécessite de comprendre le système gaz

carbonique-bicarbonates-carbonates. Ce système peut être totalement défini, comme nous
allons le montrer, à l'aide de deux variables : le pH et l'alcalinité totale.

Le pH est par définition égal au cologarithme de l'activité des ions H3O+ en solution :
pH = -log(H3O+). Dans l'eau de mer, il est généralement compris entre 8.0 et 8,3. Il
dépend en particulier de la teneur en dioxyde de carbone (c'est-à-dire de l'équilibre
photosynthèse-respiration), de la température et de la pression. Il peut atteindre 8,5 en
présence d'une forte activité photosynthétique consommatrice de CO2. En revanche, il
diminue en-dessous de la couche euphotique en raison de l'enrichissement en CO2 dû à la
minéralisation des déchets organiques. Des valeurs inférieures à 7,5 se rencontrent dans la
couche des minima d'oxygène du Pacifique Nord.

A partir de la relation d'électroneutralité de la solution eau de mer, on définit une autre

variable importante, l'alcalinité totale AT. Il suffit d'écrire cette relation (pour les ions
majeurs) en groupant d'un côté les espèces ioniques qui sont totalement dissociées
(autrement dit, dont la concentration est indépendante du pH) et de l'autre les espèces
partiellement dissociées.

[Na+]+[K+]+2[Mg++]+2[Ca++]+2[Sr++]-[Cl-]-[Br-]-[F-]-2[SO4--]
= [HCO3-]+2[CO3--]+[B(OH)4-]+[OH-]-[H+]

On fait apparaître une relation d'égalité entre 2 membres qui correspondent l'un ou l'autre
à ce que l'on appelle l'alcalinité totale d'une eau de mer. Par définition, l'alcanité due aux
carbonates est égale à AC = [HCO3-]+2[CO3--].

Puisque l'alcalinité est la traduction du bilan des charges électriques portées par les ions
majeurs de l'eau de mer, il devrait exister, conformément à la loi de Dittmar, un rapport
sensiblement constant entre alcalinité et salinité. On calcule souvent l'alcalinité normalisée
à la salinité 35 :
AT35 = AT*(35/S)
 -28-

Cette valeur devrait être unique pour une eau de mer de salinité donnée, mais en réalité
elle varie notablement. (La plage de variation pour l'océan mondial est de 7,5%, de 2,29 10-3 mole.kg-1
pour les eaux superficielles de l'océan Indien à 2,46 10-3 mole.kg-1 pour les eaux profondes du Pacifique
Nord. En Méditerranée, elle varie de 2.36 mole.kg-1 en surface à 2,41 mole.kg-1 en profondeur). Il n'est
donc pas possible de déduire l'alcalinité totale de la salinité, il faut la mesurer
indépendamment.
Les fortes variations relatives de l'alcalinité, en contradiction apparente avec la loi de
Dittmar, sont expliquées par le fait qu'elle résulte de la différence entre le nombre de
charges positives et négatives des ions majeurs. Un écart à la loi de Dittmar de
3/10000ème sur les charges positives (ou négatives), difficilement perceptible au niveau
de la salinité, entraîne une variation de 7,8% de l'alcalinité totale. Ces variations sont à
attribuer essentiellement aux écarts des ions calcium à la loi de Dittmar. En effet, le
calcium est extrait des eaux de surface par de nombreux organismes marins qui
construisent leurs coquilles avec du carbonate de calcium et il est remis en solution en
profondeur au cours de la minéralisation.

II PRINCIPE

Le principe de la manipulation est de déterminer le pH et l'alcalinité totale d'une eau de

mer de surface afin de déterminer les variables suivantes : [H+], [OH-], [B(OH)4-], pCO2,
[H2CO3*], [HCO3-], [CO32-] et AT qui caractérisent son "système carbonate".

Fig 1. Diagramme logarithmique montrant les variations des systèmes de l'acide

carbonique et de l'acide borique avec le pH (Copin-Montégut, 1989).
 -29-

Equations mathématiques régissant l'équilibre des carbonates. Variables du système et

grandeurs mesurables.

Voici 6 relations (vues en cours) qui permettent de décrire le système carbonate dans l'eau
de mer (T=25°C, S=35).

(1) KH = [H2CO3*]/pCO2 ≈ 2.8 10-2 atm-1M

H2CO3* : acide carbonique mesuré analytiquement ([H2CO3*] = [CO2] + [H2CO3])

(2) KA1=[HCO3-][H+]/[H2CO3*] pKA1 = 5.85

(3) KA2=[CO32-][H+]/[HCO3-] pKA2 = 8.94

(4) AT = [HCO3-]+2[CO3--]+[B(OH)4-]+[OH-]-[H+]

(5) [B(OH)4-] = 1.2 10-5 S (KB/([H+]+KB)) pKB = 8.61

(6) Ke = [H+][ OH-] pKe = 13.22

Ce système contient 8 inconnues [H+], [OH-], [B(OH)4-], pCO2, [H2CO3*], [HCO3-], [CO32-
] et AT. Pour une température, une salinité et une pression données, il suffit donc de se
fixer (ou de mesurer) deux des concentrations du système pour connaître toutes les autres.
Parmi ces constituants, quatre seulement sont mesurables en pratique. Ce sont le pH,
l'alcalinité totale AT, la pression partielle de CO2 et le carbone inorganique dissous total
ΣCO2 (ΣCO2 = [H2CO3*] + [HCO3-] + [CO32-]).

Dans le cas où les variables pH et AT sont mesurées, c'est-à-dire notre cas, on calcule
d'abord l'alcalinité due aux carbonates AC (AC=[HCO3-]+2[CO3--]) à partir des équations
4, 5 et 6 :

AC=AT - 1.2 10-5 S (KB/([H+]+KB)) - Ke/[H+] + [H+] (cf remarque)

On a dès lors :

pCO2 = (AC/KH * [H+]/KA1) / (1+2 KA2/[H+])

[H2CO3*] = (AC * [H+]/KA1) / (1+2 KA2/[H+])

 -30-

[HCO3-] = AC / (1+2 KA2/[H+])

[CO3--] = (AC * KA2/[H+]) / (1+2 KA2/[H+])

CT = AC * (([H+]/KA1 + 1 + KA2/[H+]) / (1+2 KA2/[H+]))

Remarque : Dans le domaine des pH habituels des eaux de mer, les concentrations des ions H+ et OH- sont
négligeables devant celles des ions HCO3-, CO3-- et B(OH)4- (Fig. 1). Il est donc généralement suffisant de
calculer l'alcalinité des carbonates sous la forme simplifiée suivante (qui rend inutile la connaissance du
produit ionique de l'eau) :
AC=AT - 1.2 10-5 S (KB/([H+]+KB))
Compte tenu de la valeur de KB (environ 10-8,6 à 25°C), on peut voir que l'alcalinité des carbonates
représente une part importante de l'alcalinité totale : 94% à pH=8.3; 96,5% à pH=8,0. C'est pourquoi il peut
être utile dans un calcul préliminaire de faire l'approximation AC=AT.

III MANIPULATION

Détermination du pH de l'eau de mer :

La mesure du pH d'une solution est réalisée par l'intermédiaire d'un montage

potentiométrique à deux électrodes; une électrode de verre indicatrice de l'activité des
ions H3O+ et une électrode de référence (c'est-à-dire qui possède un potentiel fixe comme
l'électrode au calomel par exemple).
La définition pratique du pH, recommandée par l'Union Internationale de Chimie Pure et
Appliquée, est fondée sur la différence des potentiels mesurés dans une solution standard
S de pH connu (pHs) et dans la solution X dont on désire mesurer le pH (pHx), soit :
pHx = pHs + (Ex-Es)/k
avec Ex : potentiel de l'électrode dans la solution X
Es : potentiel de l'électrode dans la solution S
k=2.3026RT/F
avec R=8.3143J.K-1
T=t+273.15
F=96487 C.mol-1
Il est donc nécessaire de posséder des solutions étalons dont le pH est connu avec
précision (étalons définis par le National Bureau of Standards NBS).
 -31-

La difficulté de la mesure du pH en milieu marin repose sur la difficulté de prendre en

compte la force ionique de l'eau de mer

Mode opératoire :

Standardisation :

La réponse de l'électrode de verre ne suivant pas toujours rigoureusement la loi de Nernst

∆E/∆pH=2.303RT/F, il est nécessaire de procéder à une calibration en plongeant
l'électrode successivement dans deux solutions étalons dont les pH encadrent la valeur du
pH à mesurer (cf notice de l'appareil).

Echantillonnage :

Le pH des eaux, dont la composition risque de se modifier au contact de l'air, doit être
mesuré de préférence in situ. Le prélèvement s'effectue immédiatement après celui destiné
à l'analyse de l'oxygène dissous, et éventuellement d'autres gaz. Les flacons, d'un volume
de 100 ml environ, sont rincés deux fois avec l'eau à analyser avant d'être remplis en
évitant tout brassage d'air (les flacons destinés à l'analyse de l'oxygène dissous peuvent
être utilisés).

Mesure :

Après avoir réalisé le montage potentiométrique et la standardisation, mesurer le pH de

l'eau de mer à analyser. Les échantillons doivent être à une température voisine de celle
de l'étalon (± 3°C) pour obtenir une précision de l'ordre de 0.02 unité pH. Rincer
l'électrode et l'essuyer légèrement. Plonger l'électrode dans le flacon et attendre l'équilibre
en agitant de temps en temps. Mesurer et noter la température de l'échantillon à ± 0.5 °C
(soit tm cette température). Le pHs (pH in situ) est calculé à partir du pH mesuré au
laboratoire (pHm):
pHs = pHm + α(tm - ts) (on considère α=0.011 pH/°C)
Pour des mesures effectuées en profondeur, il est également nécessaire d'effectuer une
correction de pression.
 -32-

Détermination de l'alcalinité totale par titrage acide de l'eau de mer :

principe :

L'alcalinité totale est déterminée par potentiométrie. L'échantillon d'eau de mer de volume
V est titré dans un récipient hermétique par une solution d'acide chlorhydrique de titre
connu C.
En tout point du dosage l'électroneutralité est vérifiée, ce qui se traduit par l'équation
suivante si on considère que v est le volume d'acide ajouté :

Cv/(V+v) = AT*V/(V+v) - [HCO3-]-2[CO3--]-[B(OH)4-]-Ke/[H+]+[H+]

Remarque : Le but de travailler dans un récipient hermétique est de considérer que l'on travaille dans un
système fermé (on opère à ΣCO2 constant). Dans le cadre de cette manipulation, les échanges de CO2 avec
l'atmosphère sont possibles mais nous considérons qu'ils ne sont pas suffisamment rapides pour induire
une modification de ΣCO2. En d'autres termes, l'approximation visant à considérer que l'on travaille en
système fermé reste valable. Par ailleurs, tous les calculs sont généralement réalisés en concentrations
massiques et non en concentrations volumiques, donc ils sont légèrement simplifiés ici.

La courbe présente deux points d'inflexion. On peut montrer que pour le deuxième, on a
[HCO3-]= [H+] (Fig. 1). En reportant cette égalité dans la relation précédente, et en
remarquant qu'à ce pH acide [CO32-], [B(OH)4-] et [OH-] sont négligeables, on obtient :

v2C = AT*V d'où la mesure de l'alcalinité totale de l'eau de mer AT = v2C/V

v2 est égal au volume d'acide versé pour atteindre le 2ème point d'inflexion.

mode opératoire :

Après avoir mesuré le pH de votre eau, titrer un volume prècis de 100 ml en ajoutant
l'acide chlorhydrique 0.02 M préparé à partir de la solution M. Titrer rapidement au début
puis de plus en plus lentement près du deuxième point équivalent. Déterminer ce point
par la méthode des tangentes (En réalité, pour plus de précision, on utilise divers
perfectionnements de la méthode de Gran qui consiste à travailler sur l'ensemble des
points au voisinnage du point équivalent). Déterminer l'alcalinité totale puis l'ensemble
des variables qui permettent de définir le système "carbonate" de votre eau.
 -33-

Dosage du calcium :

Principe :
Le principe du dosage est de complexer les ions calcium avec l'EDTA (acide éthylène
diamine tétraacétique). On utilise comme indicateur coloré le calcon qui forme un
complexe rouge avec le calcium. Lors du dosage, les ions calcium réagissent avec l'EDTA;
d'abord les ions libres puis ceux combinés avec l'indicateur qui vire alors de la couleur
rouge à la couleur bleu clair.
On se place à un pH compris entre 12 et 13 pour précipiter le magnésium sous forme
d'hydroxyde et éviter ainsi qu'il soit pris en compte dans le dosage.

Réactifs :

-Hydroxyde de sodium 2M : dissoudre environ 8 g d'hydroxyde de sodium dans 100 ml

d'eau fraîchement distillée. Conserver dans une bouteille en polyéthylène. #

-EDTA solution titrée de Na2EDTA 0,01 M : dissoudre 3,725 g de sel disodique de l'acide
éthylènediaminetétraacétique (C10H14N2O8Na2,2H2O) dans de l'eau et compléter à 1000
ml dans une fiole jaugée.

-Calcon : mélanger soigneusement 0,2 g d'acide calcone carboxylique

(C21H14N2O7S,3H2O) et 100 g de chlorure de sodium. #
Note : cet indicateur est également désigné HSN. Un autre indicateur utilisé pour le
dosage du calcium est la calcéine (C30H26N2O13).

Mode opératoire :
Diluer 5 fois votre eau de mer. A l'aide d'une pipette, introduire 50 ml exactement de cette
solution dans un bécher. Ajouter 2 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (2M) et une
pincée de l'indicateur acide calcone carboxylique.
Mélanger et doser immédiatement. Ajouter la solution d'EDTA tout en continuant à
mélanger. Verser lentement en fin de dosage. Le virage est atteint lorsque la couleur
devient nettement bleue. La couleur ne doit plus changer avec l'ajout d'une goutte
supplémentaire de la solution d'EDTA.
 -34-

Expression des résultats :

[Ca2+] = 5000.V1.M1/V2 (mM)

V1 : volume de la solution d'EDTA utilisé pour le dosage (ml).
V2 : volume d'échantillon dosé (ml)
M1 : molarité de la solution d'EDTA (M)

Réaliser trois dosages. Calculer la moyenne et l'intervalle de confiance en prenant un

risque α=5 %.

Question : Votre eau est-elle en équilibre par rapport à la calcite ?

 -35-

T.P. n° 5.
DOSAGE DE L'AZOTE ORGANIQUE DISSOUS ET DE L'AZOTE
ORGANIQUE PARTICULAIRE
Méthode de Raimbault & Slawyk (1991) et Pujo-Pay & Raimbault (1994)

I INTRODUCTION

L'étude du cycle biogéochimiques de l'azote et du phosphate repose sur la connaissance et

la quantification des différentes formes de ces éléments. Il existe de nombreuses méthodes
pour déterminer les formes organiques. Nous allons utiliser une méthode développée par
Pujo-pay et Raimbault en 1994, méthode qui permet de doser simultanément l'azote et le
phosphate, particulaire (Tot-Npart ≅ Org-Npart & Tot-Ppart) ou total (Tot-N & Tot-P). On
peut ainsi en déduire l'azote et le phosphate total dissous (Tot-Ndiss & Tot-Pdiss). Si par
ailleurs on mesure les formes minérales dissoutes de l'azote et du phosphate, on peut en
déduire la fraction organique dissoute (Org-Ndiss & Org-Pdiss).

Les différentes fractions de l'azote et du phosphate peuvent être représentées ainsi :

Tot-N

Tot-Npart≅ org-Npart Tot-Ndiss

Org-Ndiss Min-Ndiss

NH +
4 NO-3 -
NO2

Tot-P

Tot-P part Tot-Pdiss

org-Ppart Min-Ppart Org-Pdiss Min-Pdiss

o-P poly-P
(orthophosphates) (polyphosphates)
 -36-

II PRINCIPE

Le principe du dosage est de minéraliser la matière organique par autoclavage en milieu

oxydant, alcalin puis acide, et de doser les éléments minéraux formés. Dans les conditions
expérimentales, toute la matière organique est transformée en nitrate pour l'azote et en
orthophosphates pour le phosphate.

III REACTIF

Réactif pour la minéralisation# :

Ajouter directement dans la dosipette de 250 ml placée sur la balance, 15 g de persulfate

de potassium K2S2O8 (Merck 5092), 7.5 g d'acide borique (Merck 165), 70 ml d'une
solution d'hydroxyde de sodium NaOH à 60 g/l et 170 ml d'eau déionisée (milli-Q). Le
réactif doit être stocké à l'abri de la lumière

IV MANIPULATION

Pour une question de temps de manipulation, nous nous intéressons uniquement à

déterminer les différentes fractions de l'azote. Préparer vos échantillons à minéraliser puis
votre gamme étalon pour le dosage des ions nitrate + nitrite. Quand l'autoclave est en
route, passer votre gamme étalon au technicon.

Echantillonnage :

Les prélèvements sont effectués à la bouteille Niskin après les prélèvements pour l’analyse
des gaz dissous. Pour obtenir une précision correcte, il doit être demandé aux précédents
utilisateurs de ne surtout pas toucher l'embout de la bouteille Niskin avec leurs doigts
(des gants sont généralement recommandés). En cas de contamination, nettoyer l'embout
avec de l'acide chlorhydrique 10%.
Pour chaque prélèvement, rincer 3 fois le flacon avec l'eau de mer.

Minéralisation :

Réaliser les opérations suivantes en parallèle :

-Pour obtenir la concentration en azote total, prélever environ 40 ml d'eau de mer
directement dans les flacons autoclavables et ajouter 5 ml de réactif (faire 3 réplicats).
 -37-

-Pour obtenir le blanc réactif, préparer 1 flacon avec seulement 5 ml de réactif (faire 2
réplicats).
-Pour obtenir la concentration en azote particulaire, prélever 250 ml d'eau de mer dans le
flacon en plastique prévu à cet effet et les filtrer sur filtre GF/F (Les filtres dans le
dessicateur ont été préalablement calcinés au four à 450°C pendant 4 h et nettoyés à l'acide
chlorhydrique M). Placer ensuite le filtre dans un flacon autoclavable et ajouter 40 ml
d'eau déionisée (milli-Q) et 5 ml de réactif (faire 3 réplicats).
-Pour obtenir le blanc Filtre, préparer un flacon avec 40 ml d'eau déionisée (milli-Q), 5 ml
de réactif et 1 filtre (faire 2 réplicats).

Placer l'ensemble des flacons autoclavables, correctement fermés, dans l'autoclave.

VERIFIER QU'IL Y A DE L'EAU DANS L'AUTOCLAVE AVANT DE LE FAIRE
FONCTIONNER. Minéraliser pendant 30 minutes à 120°C (1 bar). Laisser refroidir les
échantillons à température ambiante avant de procéder aux analyses.

Pour le blanc Réactif, ajouter 40 ml d'eau déionisée (milli-Q) avant d'effectuer l'analyse des
sels nutritifs.

Analyse des sels nutritifs :

Le dosage de l'azote des ions nitrate + nitrite est réalisé à l'aide d'un autoanalyseur
Technicon selon le protocole développé en V.

Résultats :

Déterminer les concentrations de vos échantillons :

-en nitrate (NO3-). On considère dans notre cas que la concentration en nitrite est
négligeable devant la concentration en nitrate.
-en azote total :
Tot-N = (Htot-N - Heffet de sel - Hblanc réactif)*F*(45/40)
avec H qui correspond à une hauteur de pic et F au facteur déterminé
au paragraphe V
-en azote particulaire (prendre en considération le volume filtré)
Tot-Npart = (Htot-Npart - Hblanc filtre)*F*(45/Vfiltré)

En déduire les concentrations organiques dissoutes. Exprimer vos résultats en µM et en

µg.l-1 de N.
N'oubliez pas de bien rincer vos flacons en fin de mannipulation.
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V DOSAGE DE L'AZOTE SOUS FORME DE NITRATE ET DE NITRITE

(NO3- + NO2-)

Principe :

Les ions nitrate dans l'eau de mer sont réduits en ions nitrite (d'une manière supposée
quantitative dans ce TP) par passage sur une colonne Cd-Cu. Les ions nitrite ainsi formés
ainsi que ceux initialement présents forment un diazoïque avec la sulfanilamide en milieu
acide (pH<2) selon la réaction :

NH2SO2C6H4-NH2 + NO2- + 2H+ => [NH2SO2C6H4-N≡N]+ + 2H2O

Le diazoïque est ensuite copulé avec le chlorhydrate de N-naphtyl éthylènediamine pour

fournir un colorant azoïque :

[NH2SO2C6H4-N≡N]+ + C10H7-NH-CH2-CH2-NH2 =>

NH2SO2C6H4-N=N-C10H6-NH-CH2-CH2-NH2 + H+

La mesure de l'absorbance s'effectue à 543 nm.

Par soustraction de la concentration propre en nitrite de l'échantillon (sans passage par la
colonne Cd-Cu), il est possible de déterminer la concentration en nitrate après un
étalonnage. Dans le cadre de ce TP, la concentration en azote minéral sous forme de
nitrate + nitrite est considérée uniquement.

Modalités du dosage :

Limites d'emploi : de 0,01 à 30 µmol.l-1

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Réactifs et colonnes réductrices pour le dosage du nitrate :

-Réactif 1 : solution de Sulfanilamide#

Verser 5g de sulfanilamide (C6H8N2O2S) dans 500 ml d'eau déionisée (milli-Q). Ajouter
50 ml d'acide chlorhydrique concentré (HCl 37%). Agiter. Compléter à 1000 ml d'eau
déionisée (milli-Q). Ajouter 1 ml de BRIJ (mouillant).

-Réactif 2 : Solution de N-naphtyl éthylènediamine dichlorhydrate#

Dissoudre 500 mg de N-naphtyl éthylènediamine dichlorhydrate (C12H16Cl2N2) dans
1000 ml d'eau déionisée (milli-Q).

-Réactif 3 : Solution de chlorure d'ammonium#

Dissoudre 15 g de NH4Cl dans 1000 ml d'eau déionisée (milli-Q). Ajouter 2 ml
d'ammoniaque pour amener le pH autour de 8.

-Solution étalon de nitrate à 5 mM (solution A)#

Dissoudre 0,506 g de nitrate de potassium KNO3 anhydre dans 1000 ml d'eau déionisée
(milli-Q). Ajouter 2 gouttes de chloroforme et conserver la solution à l'abri de la lumière
dans un flacon hermétiquement fermé.

-Solution étalon de nitrate à 100 µM (Solution B à préparer chaque jour)

Dans une fiole de 100 ml préalablement rinçée, verser précisément 2 ml de la solution A.
Compléter à 100 ml avec de l'eau déionisée (milli-Q).

-Solutions standards :
Rincer 4 fioles de 100 ml (marquées 1, 2, 5, 10) avec de l'eau déionisée (milli-Q). Verser
précisément 1 ml de solution B dans la fiole 1, 2 ml dans la fiole 2, 5 ml dans la fiole 5 et 10
ml dans la fiole 10. Compléter à 100 ml chacune des fioles.
Selon les échantillons à analyser, des solutions standards plus ou moins concentrées
peuvent être préparées.

-Préparation de la colonne de cadmium#

Préparation du cadmium#
Laver plusieurs fois le cadmium à l'acétone afin de le dégraisser.
Rincer scrupuleusement à l'eau déionisée (milli-Q).
Nettoyer à l'HCl 10% plusieurs fois.
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Rincer plusieurs fois à l'eau déionisée (milli-Q).

Attaquer le cadmium avec de l'acide nitrique (HNO3) à 0.5 M (attention : dégagement
gazeux très dangereux, à ne pas respirer). Remuer plusieurs fois et attendre environ 5
minutes
Rincer de nouveau à l'HCl 10% après avoir enlevé le maximum d'acide nitrique.
Rincer à l'eau déionisée (milli-Q).
Mettre le cadmium dans une solution de sulfate de cuivre (CuSO4 20 g.l-1). Bien remuer.
Laisser agir. Le cadmium ne doit plus être en contact avec l'air à partir de ce moment.
Rincer plusieurs fois avec le chlorure d'ammonium (NH4Cl 15 g.l-1, réactif 3), sans jamais
exposer le cadmium à l'air.
Quand tout le sulfate de cuivre est éliminé, le cadmium peut être stocké dans la solution
de chlorure d'ammonium.

Préparation de la colonne# :
Prendre une colonne de verre. Installer un bouchon de laine d'argent à une de ses
extrémités. Prolonger la colonne par un tuyau en plastique à cette même extrémité.
Remplir la colonne et le tuyau avec du NH4Cl et clamper le tuyau. Vérifier qu'il n'y ait
aucune bulle d'air dans la colonne.
Remplir la colonne avec le cadmium préparé sans faire entrer de bulle d'air dans la
colonne. Mettre un autre bouchon de laine d'argent à l'autre extrémité et fermer avec le
tuyau en ayant pris soin de le remplir de NH4Cl afin qu'il n'y ait aucune bulle dans la
colonne.

Mise en place dans le circuit# :

Le circuit nitrate étant fonctionnel (réactif 3 branché), enlever la colonne à changer au
niveau du robinet de fermeture. Le NH4Cl s'écoule alors librement. Enlever un côté du
tuyau plastique de la colonne neuve. La raccorder au robinet. Le NH4Cl circule alors dans
toute la colonne neuve. Après qu'il se soit écouler quelques secondes, enlever totalement
le tuyau plastique et raccorder la colonne à l'autre extrémité.
Récupérer le cadmium de la colonne enlevée dans un flacon contenant du NH4Cl afin de
le retraiter ultérieurement.
Lors de la première mise en place, faire passer pendant quelques minutes, comme pour
un échantillon, une solution très concentrée de nitrate (solution B par exemple) afin
d'activer la colonne neuve. Bien rincer le système afin de retrouver une ligne de base
correcte.
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Dosage (à réaliser en présence du responsable des TP) :

Allumer les colorimètres.

Remplir les flacons qui alimentent en eau deionisée .
Placer la porte sur la pompe et la mettre en marche. Après quelques minutes, vérifier la
circulation dans les tuyaux et la régularité du bullage. Contrôler l'absence de fuite.
Brancher les réactifs. Après 5 minutes, ouvrir la colonne Cd-Cu si aucune bulle d'air ne
risque d'y entrer. Attendre 5 minutes.
Allumer les enregisteurs. Régler la ligne de base avec le zéro du colorimètre.
Lorsque la ligne de base est stable, passer les standards. Si les valeurs obtenues sont
correctes, vous pouvez passer vos échantillons.
En fin de dosage, fermer la colonne Cd-Cu, débrancher les réactifs et mettre le circuit en
rinçage pendant 15 minutes avec de l'eau déionisée (milli-Q). Eteindre l'enregistreur,
enlever la porte de la pompe et éteindre le colorimètre.

Détermination de l'effet de turbidité dû à l'eau de mer ou effet de sel :

Enlever le réactif 2, le remplacer par de l'eau déionisée (milli-Q).

Attendre la stabilisation de la nouvelle ligne de base puis passer quelques échantillons de
manière normale (garder les mêmes calibres que ceux choisis pour l'analyse des
échantillons).
Les pics obtenus sont dûs à la turbidité de l'eau de mer et leurs hauteurs sont à retrancher
des hauteurs des pics des échantillons d'eau de mer (environ 0.1 cm pour le circuit nitrate
au calibre 3).

Mesures des hauteurs de pics, calcul des concentrations.

STANDARDS :

Relier les lignes de base qui encadrent les standards. Mesurer la hauteur des pics en cm à
partir de cette ligne. Le facteur F se calcule en divisant la concentratiuon de l'étalon C par
la hauteur H du pic correspondant :
F = C/H

La hauteur H des pics est fonction du calibre choisi, le facteur F qui en découle n'est
applicable qu'aux échantillons analysés sur le même calibre (calibre 3 pour une
concentration comprise entre 0 et 10 µmole.l-1)
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ECHANTILLONS D'EAU DE MER :

Relier les lignes de base qui encadrent une série d'échantillons (en principe tous les 10-15
échantillons). Mesurer chaque pic à partir de cette ligne.
La concentration se calcule en retirant à chaque hauteur de pic la valeur de l'effet de sel
(sur le même calibre de préférence) et en multipliant cette hauteur par le facteur F
correspondant au même calibre :
C = (H - effet de sel) x F.

Sur la voie nitrate , le sel dosé est en fait nitrite + nitrate; pour avoir la valeur réelle du
nitrate il suffirait de retrancher aux valeurs trouvées la valeur du nitrite correspondant
([N03-]= (H - effet de sel) x F - [NO2-].
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Références :

-Carpenter, J.H. 1965. The accuracy of the Winkler method for dissolved oxygen analysis. Limnol. Oceanogr.
10, 135-140.
-Carritt, D.E. & J.H. Carpenter. 1966. Comparison and evaluation of currently employed modifications of the
Winkler method for determining dissolved oxygen in sea-water; a NASCO Report. J. Mar. Res. 24, 286-318.
-Copin-Montégut, G. 1989. Physico-Chimie de l'eau de mer. OCEANIS, volume 15.
-Koroleff, F. 1969. Direct determination of ammonia-Ammonium equilibrium in natural waters as
indophenol blue. ICES, C.M. 1969/C 9. Hydr. Comm.
-Marker, A.F.H. 1972. The use of acetone and methanol in the estimation of chlorophyll in the presence of
pheophytin. Freshwater Biology. 2: 361-385.
-Millero, F.J. & A. Poisson. 1981. International one-atmosphere equation of state of seawater. Deep Sea
Research. 28A(6) : 625-629.
-Murphy, J. and J.P. Riley. 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in
natural waters. Anal. Chem. Acta. 27. 31-36.
-Neveux, J., D. Delmas, J.C. Romano, P. Algarra, L. Ignatiades, A. Herbland, P. Morand, A. Neori, D. Bonin,
J. Barbe, A. Sukenik and T. Berman. 1990. Comparison of chlorophyll and phéopigment determinations by
spectrometric, fluorometric, spectrofluorometric and HPLC methods. Marine Microbial Food Webs. 4(2) :
217-238.
-Nusch, E. A. 1980. Comparison of different methods for chlorophyll and phaeopigments determination.
Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol. 17:14-36.
-Pujo-pay, M & P. Raimbault. 1994. Improvement of the wet-oxidation procedure for simultaneous
determination of particulate organic nitrogen and phosphorus collected on filters. Mar. Ecol. Prog. Ser., 105 :
203-207.
-Raimbault, P. & G. Slawyk. 1991. A semi-automatic, wet oxidation method for the determination of
particulate organic nitrogen collected on filters. Limnol. Oceanogr., 36 : 405-408.
-Robert, G. 1983. Chlorophylle a et paramètres de fluorescence en zone néritique perturbée et région
d'upwelling. Thèse de l'Université d'Aix-Marseille 2. 95 p.
-Solorzano, L. 1969. Determination of ammonia in natural waters by the phenolhypochlorite method.
Limnol. Oceanogr. 14(5). 799-801.

-Strickland et Parsons. 1968. A practical handbook of seawater analysis. Fisheries Research Board of
Canada, Ottawa.
-44-
 -45-

Rappel de statistiques :

Calcul des intervalles de confiance :

Considérons une variable ayant une distribution normale, ce qui est généralement le cas
en chimie analytique. Considérons également que la moyenne de plusieurs résultats tend
vers la valeur vraie : c'est à dire qu'il n'y a pas d'erreur systématique (comme par exemple,
la dérive d'un appareil de mesure qui entraînerait systématiquement une sous- ou une
sur-estimation de la moyenne des résultats par rapport à la valeur vraie). On peut alors
calculer l'intervalle de confiance autour de cette valeur moyenne.

Pour un nombre d'échantillons (N) inférieur à 30, l'intervalle de confiance est égal à

x ± tSm
avec :

t donné par la table de Student pour ν = N - 1 degrés de liberté

et
N

∑ (xi − x )
i =1
2

S
S= et Sm =
N −1 N

Test de la validité du modèle linéaire :

Afin de comparer deux méthodes d’analyse d’un même composé, on peut calculer le
coefficient de correlation R entre ces deux variables. Le test qui permet de dire si le
modèle linéaire peut être accepté se réfere à la table des valeurs critiques du coefficient de
correlation affichée en salle de TP.
Il peut être interessant d’effectuer une regression linéaire entre les deux variables et de
discuter sur la pente et l’ordonnée à l’origine.
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Conseils pour la rédaction des compte-rendus :

Les compte-rendus doivent être succints (une feuille double maximum). Il ne doivent
renfermer que les données indispensables pour vérifier les résultats et permettre la
compréhension de la manipulation.
Dans ce but, toutes les réactions chimiques mises en jeu au cours des titrages ainsi que les
résultats expérimentaux doivent être indiqués très clairement.

En ce qui concerne les résultats, il est essentiel :

-de préciser à quoi ils se rapportent (quelle eau, quelle profondeur,...)

-de préciser les unités choisies (M, g.l-1,...)
-de calculer les intervalles de confiance quand vous faîtes plus de 2 réplicats.
-de ne présenter que des décimales ayant une signification par rapport à la
précision de la méthode employée.