Protocole d’extraction de l’ADN 

La listéria monocytogène est Gram positive, donc on réalisera le 1.B

1A. Préparation du lysat (bactéries Gram négatives)

a. Appliquer maximum 1 ml de lait dans un tube de micro centrifugation.

Remarque : il est recommandé de prélever jusqu'à 1 ml de lait pour les échantillons de lait
normal ou de mammite subclinique. Pour les échantillons de mammite clinique, en
particulier ceux qui présentent une numération leucocytaire élevée, il est recommandé de
prélever jusqu'à 200 ml d'échantillon de lait. Si l'échantillon est très visqueux et difficile à
pipeter, passer l'échantillon dans une seringue de calibre 18 plusieurs fois pour réduire la
viscosité.

b. Centrifuger à 14 000 RPM (~20 000 x g) pendant 3 minutes.

c. Verser le surnageant en inversant rapidement le tube et en le tapant doucement contre la paroi du

conteneur à déchets.

Remarque : Ce tapotement a pour but de s'assurer que la couche crémeuse présente sur le
dessus de l'échantillon de lait après la centrifugation est bien enlevée. La couche crémeuse
présente sur le dessus de l'échantillon de lait après la centrifugation. Veiller à ce que le culot
ne soit pas délogé.

d. Ajouter 400 µL de tampon SK et bien mélanger au vortex.

e. Passer à la section 2 : Liaison de l'échantillon à la colonne.

1B. Préparation du lysat (bactéries inconnues ou Gram positif)

a. Appliquer maximum 1 ml de lait dans un tube de micro centrifugation.

Note : Il est recommandé de prélever jusqu'à 1 ml de lait pour les échantillons de lait normal
ou de mammite subclinique. Pour les échantillons de mammite clinique, en particulier ceux
présentant un nombre élevé de leucocytes, il est recommandé d'utiliser jusqu'à 200 ml
d'échantillon de lait. Si l'échantillon est très visqueux et difficile à pipeter, passer l'échantillon
dans une seringue de calibre 18 plusieurs fois pour réduire la viscosité.

b. Centrifuger à 14 000 TPM (~20 000 x g) pendant 2 minutes.

c. Verser le surnageant en inversant rapidement le tube et en le tapant doucement contre la paroi du

conteneur à déchets.

Note : Ce tapotement a pour but de s'assurer que la couche crémeuse présente sur le dessus
de l'échantillon de lait après la centrifugation est bien enlevée. Veiller à ce que le culot ne
soit pas délogé.

d. Remettre le culot en suspension dans 100 µL de la solution de remise en suspension A (avec

lysozyme). Incuber à 37°C pendant 45 minutes. Mélanger la solution de temps en temps par vortex.

Note : S'assurer que le lysozyme fourni a été ajouté à la solution de remise en suspension
e. Après incubation, ajouter 300 µL de tampon SK et 10 µL de protéinase K reconstituée au mélange
de digestion et bien mélanger par vortex.

f. Incuber le lysat à 55°C pendant 45 minutes. Mélanger le lysat de temps en temps par vortex.

g. Passer à la section 2 : Liaison de l'échantillon à la colonne.

2. Liaison de l'échantillon à la colonne

a. Ajouter 200 µL d'éthanol à 96-100% (95%) au mélange de lyse et mélanger au vortex.

b. Assembler une colonne avec l'un des tubes de collecte fournis.

c. A l'aide d'une pipette, transférer soigneusement le lysat mélangé à l'éthanol dans la colonne
d'essorage.

d. Centrifuger l'assemblage de la colonne pendant 2 minutes à 14 000 TPM (~20 000 x g) pour lier
l'ADN bactérien.

Note : Si tout le liquide ne passe pas à travers la colonne, centrifuger pendant 2 minutes
supplémentaires à 14 000 RPM (~20 000 x g) pour lier l'ADN bactérien. Si une petite quantité
de liquide reste en haut de la colonne, passer à l'étape 3a avec la même quantité de tampon
SK.

3. Lavage de la colonne

a. Appliquer 500 µL de tampon SK sur la colonne et centrifuger pendant 2 minutes.

b. Jeter l'écoulement et réassembler la colonne et le tube collecteur.

c. Appliquer 500 µL de solution de lavage A sur la colonne et centrifuger pendant 1 minute à 14 000
TPM (~20 000 x g).

Note : S'assurer que la totalité de la solution de lavage est passée dans le tube de collecte en
inspectant la colonne. Si la totalité du volume de lavage n'est pas passée, centrifuger
pendant une minute supplémentaire.

d. Jeter l'écoulement et remonter la colonne d'essorage avec son tube collecteur.

e. Appliquer 500 µL de solution de lavage A sur la colonne et centrifuger pendant 1 minute à 14 000
TPM (~20 000 x g).

f. Jeter le surnagent et réassembler la colonne d'essorage avec son tube collecteur.

g. Centrifuger pendant 2 minutes à 14 000 TPM (~20 000 x g) pour s'assurer que la colonne soit
complètement sèche.

h. Jeter le tube de collecte.

4. Élution de l'ADN

a. Transférer la colonne d'essorage dans un tube d'élution de 1,7 ml.

b. Appliquer 100 µL de tampon d'élution B à la colonne et centrifuger à 2,000 TPM (~425 x g),
pendant 2 minutes.

c. Essorer pendant 1 minute supplémentaire à 14 000 RPM (~20 000 x g) pour terminer l'élution de
l'ADN.

Note : Pour un échantillon plus concentré, 50 µl de tampon d'élution B peuvent être utilisés.

d. L'échantillon d'ADN purifié peut être conservé à 4°C pendant quelques jours. Il est recommandé
de placer les échantillons à -20°C pour un stockage à long terme.

5. Protocole dosage de l’ADN :

 Réaliser un blanc, dans une cuve de spectrophotomètre de l'eau déminéralisée. lancer la
machine pour un blanc.
 Dosage de notre ADN : placer notre solution dans une cuve de spectrophotomètre, lancer la
machine, relever le résultat.
 Effectuer la conversion pour connaître la concentration d’ADN dans notre échantillon.
Calcul :
|¿|50
C ADN = =… ng/ µL
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