Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la

Recherche Scientifique
Université de Tunis EL Manar
Institut Supérieur des Sciences Biologiques
Appliquées de Tunis

Rapport final des activités pratiques d’identification et contrôle des

microorganismes pathogènes

Présenté par :

Saoud safae

laabidi islem

Rkiai hadil

BTM3 groupe 4

Analyse microbiologique du fromage râpe

Année Universitaire : 2023-2024

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Introduction :
La biotechnologie microbienne joue un rôle essentiel dans le contrôle
microbiologique des aliments. Elle repose sur l'utilisation de micro-organismes,
tels que des bactéries, pour diverses applications dans l'industrie alimentaire. Les
micro-organismes peuvent être à la fois bénéfiques et nuisibles, ce qui souligne
l'importance du contrôle microbiologique.

Dans le domaine de l'alimentation, les bactéries lactiques telles que Lactobacillus

et Streptococcus sont largement utilisées pour la fermentation des produits
laitiers, tels que le yaourt et le fromage. Ces bactéries contribuent à la
transformation des matières premières et à la conservation des aliments.
Cependant, certaines bactéries pathogènes, comme Salmonella et Escherichia
coli, peuvent contaminer les aliments et entraîner des infections alimentaires
graves. C'est pourquoi le contrôle microbiologique des aliments est crucial pour
garantir la sécurité et la qualité des produits alimentaires que nous consommons.

I. But :
Le but d'une expérience de recherche des germes dans le fromage râpé pourrait
être de déterminer la présence et la diversité des micro-organismes (germes)
présents dans ce produit alimentaire. Cela pourrait être utile pour évaluer la
qualité sanitaire du fromage râpé et mieux comprendre les processus de
fermentation ou de contamination potentielle.

II. Principe :

Analyses microbiennes nous aident à contrôler la sécurité et l'efficacité des

ingrédients, des aliments semi-manufacturés, des produits finis et des processus.

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 Avec un réseau international de laboratoires d'analyses microbiologiques,
équipés d'une technologie de pointe et d'experts utilisant les standards d'essais
les plus modernes.
III. Materiel et methode :
Matériels
 Première étape : Pesée
Figure1 : Poste de sécurité microbiologique
Figure 2: diluteur gravimétrique
Figure 2: Materiel sterile
Méthodes
on précède notre travail par la désinfection des mains
et de la zone de travail pour éviter tout risque de
contaminations extérieurs.
Sous une hotte : A l’aide d’une spatule stérile On place
10g d’échantillon de fromage râpée dans un sac adapté
à la diluteur gravimétrique. En effet cet appareil nous
permet de réaliser des dilutions fiables et automatisées
de façon rapide, précise et sécurisée alors la quantité
parfaite de diluant « l’eau peptonnée tamponnée » est
ajoutée en quelque secondes.
Ensuite, la solution obtenue est homogénéisée au
travers d’un broyeur.
3
figure 4: broyeur de laboratoire
 Deuxième étape : Dilutions décimales :
Figure 5: Dilution
Figure6 : prélèvement a l’aide d’une propipette
Figure7 : Les dilutions obtenues
Dans un milieu stérile (sous une hotte), on commence
par la préparation d’une série de dilutions de 0 à 5 ;
dont un volume de 1ml de la solution mère est inoculé
à l’aide d’une propipette associée à une pipette
graduée dans des tubes à essai, préalablement remplis
avec 9ml d’eau peptonnée. A l’aide d’un agitateur
vortex, on fait agiter le contenu pendant 5 à 10
secondes afin d’obtenir la dilution 10-2. cette opération
sera répétée de la même manière pour obtenir les
dilutions suivantes 10-3,10-4 et
10-5(figure 5).
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  Deuxième étape : ensemencement A partir des dilutions décimales allant de 10-5 à 10-1,
 Ensemencement en surface
porter aseptiquement 0.1ml dans des boites de pétri
contenant le milieu PCA
« qui est un milieu nutritif sans inhibiteur utilisé pour
le dénombrement de la portion revivifiable de la flore
mésophile aérobie totale (norme AFNOR NF T 90-401
et402°) dont l’intérêt est de favoriser le développement
à30°c de tous les microorganismes qu’on y a déposés.»
Ensuite on étale toute la suspension sur ce milieu.

 Deuxième étape : ensemencement On refait la même méthode pour le milieu Baird-Parker.

 Ensemencement en surface
Il s’agit d’un milieu de culture sélectif et différentiel
employé en microbiologie pour l’isolement et
l’identification du pathogène Staphylococcus aureus
issus d’échantillon alimentaires, environnementaux et
cliniques.
 Chaque étape de prélèvement des dilutions
Gélose Baird-Parker Bec bensun
décimale et les transferts dans ses boites de
pétri adéquates est précédé par
l’homogénéisation à travers le vortex.

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  L’étalement de l’inoculum à la surface d’un
milieu gélosé se fait à l’aide d’un étaloir
 Cette expérience est manipulée autour de bec
bensun pour éviter toute contamination.
Laisser la gélose solidifier sur une surface froide.

Homogénéisation à l’aide d’un

vortex

Prélèvement des dilutions décimales à l’aide d’une

micropipette

T R AN SF E R T SU R L E S B OIT E S D E P E T R I ET AL EM EN T

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  Ensemencement en profondeur :
Figure : Transfert d’inoculum sur les boites
Figure : L’ajout du VRBL figure : L’addition du CFC
Figure : mouvement circulaire pour l’homogénéisation
Figure : bain marie pour maintenir les milieux de culture
A partir des dilutions décimales allant de 10-5 à 10-1,
porter aseptiquement 1 ml dans 15 boites de pétri
différentes vides préparé a cet usage.
Ensuite on dépose dans 5 boites le milieu de culture
suivant :
CFC : c’est un milieu sélectif utilisé pour l’isolement et
l’identification de pseudomonas.
Ensuite on ajoute dans les dix boites de pétries
contenants des dilutions décimales le VRBL
VRBL : est un milieu qui permet d’isoler les coliformes.
Le mode d’incubation de ce milieu est différente .en
fait, le VRBL à 37°C permet d’identifier les coliformes
tandis que le VRBL à 44°c permet d’isoler les coliformes
thermotolérent.
Faire ensuite des mouvements circulaires environ 30s
et de va-et-vient en forme de 8 pour permettre à
l’inoculum de bien se mélanger à la gélose utilisée.
 Laisser les boites solidifier sur surface froide.
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  troisième étape : Incubation Des que la gélose se solidifie on incube pendant 48h :
Le milieu PCA à 30°c
Le milieu Baird-Parker et VRBL à 37°c.
Le milieu CFC à 25°C.
Le milieu VRBL à 44°c.

Figure : incubateur

 dernière étape : stérilisation

Stériliser à l’aide d’alcool la zone de travail et laver les
matériels de laboratoire.

Figure : stérilisation

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1. Les milieux de culture en microbiologique alimentaire :
 La gélose PCA (Plate Count Agar) : Le milieu PCA est non sélectif et relativement riche

en nutriments, la tryptone, les facteurs vitaminiques de l'extrait de levure et le glucose

utilisé comme source énergétique favorisent la croissance de la plupart des bactéries.

 La gélose VRBL est un milieu sélectif pour l’isolement et la numération des coliformes

dans l’eau, le lait et les autres produits laitiers, le matériel de laiterie et autres denrées

alimentaires.

 Gélose Cetrimide, ou gélose Pseudomonas Cetrimide, est un milieu sélectif et

différentiel utilisé pour l'isolement et l'identification de Pseudomonas aeruginosa à

partir d'eau et d'échantillons cliniques.

 Gélose Baird-Parker est un milieu sélectif pour le dénombrement de Staphylococcus

aureus dans les aliments qui a été signalé pour la première fois par Baird-Parker (1962).

C'est un milieu différentiel modérément sélectif servant à l'isolement et à

l'énumération des Staphylococcus aureus issus d'échantillons alimentaires,

environnementaux et cliniques.

2. Les indicateurs de la qualité microbiologique du fromage râpe :

Généralement l’analyse d’un aliment n’est pas systématique et elle peut reposer sur des

présomptions .Le contrôle de qualité sanitaire est basé sur la numération des germes

totaux (mésophile totale) de l’aliment et sur la recherche de germes indicateurs de

contamination fécale tels que les coliformes totaux et la recherche en fonction de la nature

du produit sur la recherche de germes ubiquitaires et d’origine humaine ou animale

comme le Staphylococcus aureus

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 3. Les carcteristiques des bactéries :
 Coliforme thermotolérant :

Les colonies sont violacées, diamètre supérieur ou égal à 0.5 mm et parfois entourés d’une zone
rougeâtre du a la précipitation de la bile.

 Staphylococcies aureus :

*Colonies caractéristiques

 Noires ou grises, brillant et convexes entourés d’une auréole d’éclaircissement.

 Ayant une taille 1mm a 1.5mm de diamètre après 24h d’incubation.
 On peut distinguer entre colonie caractéristiques et non caractéristiques.
 Mésophile : compter tous les colonies dans les boites

 Pseudomonas :

Sont considérées comme colonies pseudomonas, celle qui présentent une réaction positive à l’oxydase,et qui
présentent un développement uniquement en surface(aérobie).

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  Coliforme

Les colonies sont violacées

IV. Résultat :
10- 1 1 0- 2 1 0- 3 10- 4 10 - 5

S.aureus 0 0 0 0 0

Pseudomonas CC CNC CC CNC CC CNC CC CNC CC CNC

spp 0 >300 0 0 0 0 0 0 0 0

CC CNC

Coliforme 6 Indénombrable CC CNC 0 0 0

30 Indénombble

Coliformes CC CNC
thermo 18 12 CC CNC CC CNC 0 0
tolérants Tapis >300 4 0 0 0
Mésophile TAPIS >3 0 0 383 210 17

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 CC : colonie caractéristique

CNC : colonie non caractéristique

V. Denombrement :

S.aureus Coliformes Coliformes thermo Mésophile

tolérant

Boîtes choisies entre 15 Boites choisies entre 15 et Boites contenant entre Compte tout les boîtes
et150 150 : 15 et 300 colonies : ∑c
∑c
N=(𝒏𝟏+𝟎𝟏𝒏𝟐)𝒅
N=(𝒏𝟏+𝟎𝟏𝒏𝟐)𝒅
∑c ∑c
N=(𝒏𝟏+𝟎𝟏𝒏)𝒅 N=(𝒏𝟏+𝟎𝟏𝒏𝟐)𝒅 ∑c :est la somme des colonies
dans tout les boîtes
∑𝐜 : est la somme des a :colonies inférieur 15
n1 :nombres des boîtes
colonies comptées sur deux ∑𝐜 : est la somme des d :Taux de première
retenus à la première dilution
boites retenus colonies comptées sur deux dilution mère
n2 :nombres des boîtes
N1 :nombres des boîtes boîtes retenus Pour la dilution
retenus à la deuxième
retenus à la première n1 :nombres des boîtes 10-1 = 18
dilution
dilution retenus à la première dilution 10_2=4
d :taux de dilution
n2 :nombres des boîtes n2 nombres des boîtes retenus
correspondant à la
retenus à la deuxième à la deuxième dilution Donc on a :
première dilution
dilution N= 18+4/10-1x1.1
N=383+210+17
d: taux de dilution =200 UFC /g
/1.1×10-3
d: taux de dilution correspondant a la première Nombre estime
N=554545UFC/g
correspondant a la dilution n<15
≈554500UFC/g
première dilution Pour la dilution Ne=a//b
N=554500>N seuil
10-1=6 Ne=4/10-2
=10000UFC/g
Donc on a : 10-2=30 N=400UFC/g
Absence des colonies dans N=6+30/1.1×10-1 n=0
tout les boîtes. =327.27 ≈300UFC/g N<1×1/d
N=0/0×10 -1=0 N=300>N seuil =10UFC/g N<10UFC/g
UFC/g

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 VI. Test de confirmation :
 Isolement :

Test de confirmation de Pseudomonas spp

o Prélever, au hasard, 5 colonies sur chacune des
boîtes. Si une boîte contient moins de 5 colonies,
les prélever toutes.
o Steriliser l’anse de platine par flambage et la
refroidir par l’air puis Ensemencer en stries, sur
des boîtes de gélose kligker hajna qui contien des
sucres qui sont : glucose (culot) et lactose (pente),
chacune des colonies sélectionnées en vue de la
F IG U RE 3 : PR EL EV EM EN T D ' U N E C O L ON I E ET
E N SE MEN CE ME N T confirmation
o Incuber ces boîtes à 25°C pendant au moins de
24h. Sélectionner une colonie bien isolée à partir
de chacune des boîtes pour la confirmation
biochimique

F IG U RE 4 : IN C U B AT I ON

Resultat de l’incubation

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 Interprétation :
Comparaison notre tubes par rapport témoin positive et témoin
négative
 Par rapport témoin positive
On constate la présence de poussé bactérienne au fond des tubes
F IG U R E 5 : T E M OI N P O SI T IV E
ce qui prouve l’absance de Pseudomonas spp puisqu‘elle est une
bactéries aérobie strict.

 Par rapport témoin négative

On constate la présence des coloration de gélose en jaune au lieu
en rouge
F IG U R E 6 : T E M OIN N EG A T I F
 Donc on conclure l’absence de Pseudomonas spp
Expression des résultats :
formule 1:
𝐵 0
a=𝐴 ×c= 5×300=0UFC/g

oú:
a : nombres de microorganismes identifiés
A:est nombre de colonies sélectionnés pour
confirmation (5colonies )
b:nombres de colonies répondent aux critères
d’identification
c:nombres totale de colonies dénombrées
formule 2:
∑𝑐
N= v(n1+0.1n2)d
0
N=1ml (1+0.1×1)×10−1=0UFC/g

N<valeur seuil=1000UFC/g

N:nombres de microorganismes identifiés présent dans

l’échantillon pour essai ,en tant que moyenne
pondére,pour deux dilution successive
c:somme des colonies compte après identification sur

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 toute boîte retenus
v: volume en millilitre de l’inoculum appliqué à chaque
boîte
n1:nombres de colonies retenu à la première dilution
n2:nombres retenu à la seconde dilution
d:taux de dilution correspondant à la première dilution
retenu
estimation de petit nombre
n <15
𝑦
Ne=𝑑 Où

Y:moyenne arithmétique
d:taux de la dilution mère de suspension mère
0
Ne= =0UFC/g
10−1

VII. Discussion et conclusion :

Les resultas des analyses microbiologique des echantillons de fromage rapé
soumis a l’éssai révèlent la presence des germes pathogénes tels que les
coliformes totaux et les mysophiles, avec des niveaux de contamination
dépassant les seuils autorisés.En conséquence, notre échantillon de fromage
rapé ne respecte pas les normes en raison du dépassement des limites etablies
pour le nombre de colonies .

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