Université L’arbi Ben M’hidi, Oum El-Bouaghi - Département SNV

2ème année LMD - Matière : Microbiologie

TD 1 : Techniques d’ensemencement et d’isolement bactérien

L’ensemencement est la mise en culture des microorganismes d’un échantillon donné sur un milieu
nutritif. Il vise donc à favoriser la multiplication des germes sur un milieu de culture. Il doit être effectué dans
des conditions d’asepsie rigoureuses, à partir d’un échantillon, avec une anse de platine ou une pipette Pasteur. Il
peut être réalisé sur un milieu de culture solide ou liquide.
Sur un milieu de culture solide, l’ensemencement d’un échantillon donnera naissance à des colonies
microbiennes isolées. Dans ce cas, l’ensemencement ou en d’autre terme l’isolement consiste à séparer les divers
microorganismes d’un mélange. Il permet :
 D’isoler une ou plusieurs souches contenues dans un mélange ;
 Vérifier la pureté d’une souche étudiée.
Techniques d’ensemencement
1. Technique d’ensemencement par épuisement (exp. Technique des 4 quadrants)
Elle consiste à disperser le germes à la surface d’un milieu solide (Dans une boite de Pétri) afin d’obtenir des
colonies bien isolées.

2. Technique d’ensemencement par écouvillonnage ou par râteau

Elle consiste à réaliser un ensemencement très riche, c’est-à-dire sur la surface totale du milieu de culture.
3. Technique d’ensemencement en masse
Elle consiste à déposer l’échantillon (dans un tube à essai ou dans une boite de Pétri) et rajouter la gélose dessus
refroidie à 45°C.
4. Technique d’ensemencement dans un tube à gélose inclinée
Elle consiste à ensemencer la pente de la gélose par des zigzags toujours du bas en haut.
5. Technique d’ensemencement dans un tube à gélose en culot
L’ensemencement se fait par une piqure centrale.
6. Technique d’ensemencement dans un tube à gélose inclinée + un culot
Elle consiste à ensemencer tout d’abord la pente par des zigzags puis le culot par piqure centrale.
N. B. Dans certains cas, l’échantillon à étudier nécessite une dilution préalable avant l’ensemencent. Cette
dilution va nous aider à avoir des colonies bien isolées ce qui va nous faciliter l’estimation quantitative
(dénombrement) du contenu microbien de notre échantillon.
 Figure 1 : Préparation des dilutions.
A partir de chacune des dilutions préparées (Fig. 1), on prélève 0,1 ml et on ensemence, par rateau, une
boite de Pétri contenant un milieu gélosé. Les boites sont incubées par la suite à 30° C pendant 24H.
Après incubation, on ne considère que les boites contenant un nombre de colonies compris entre 30 et 300
colonies. Pour estimer le nombre de bactéries dans l’échantillon, on applique la formule suivante :

N= n x 1/D x 1/Ve UFC/ml

N : le nombre de bactéries dans la solution mère ;
n : le nombre des colonies compté sur la boite ;
D : facteur de dilution ;
Ve : volume ensemencé ;
UFC : Unité Formant Colonie.