Université Mhamed Bougara Boumerdes

Faculté des Technologie FT / DGP

Réaliser par :
- KHIREDDINE Fatiha

Groupe : MGEV 19

Matière : Microbiologie Environnementale

Compte rendu de TP

Techniques d’ensemencement

Année 2019-2020
Ensemencement de bactéries
Sur milieu solide et milieu liquide

1-Objectif
Afin de pouvoir une espèce bactérienne de façon convenable il faut faire des tests ou des
expériences dessus.il est souvent utile d’avoir une quantité importante de bactéries. pour cela,
on multiplie la souche en réalisant des ensemencement sur une gélose ou dans un milieu
liquide adapte.

2-Définition

L'Ensemencement
En microbiologie : l’ensemencement est l’étape de transport entre votre milieu ou bactéries
recherchées (repiquage, bouillon, …) et votre milieu de culture. Comme tout transport, une
concurrence est présente pour déposer votre simple milieu mère.

Ensemencement à l’aide d’une « pipette Pasteur »

Ensemencement à l’aide d’une anse1.

3-Quelques règles élémentaires concernant l’ensemencement

- Travailler en zone stérile La désinfection de vos paillasses
Le pipetage à la bouche est strictement interdit (risques de contamination bactériologique)
- La pipette Pasteur ne sert qu'une fois seulement
-Tester la stérilité de boites coulées : incuber les boites dans une étuve à 35°C pendant 18 à
24h, même haut de là, l’absence de culture bactérienne valide le test.
- L’ensemencement doit être effectué dans des conditions d’asepsie rigoureuses à partir d’un
prélèvement d’une colonie ou d’un bouillon bactérien avec une anse de platine ou une pipette
de pasteur, peut être réalisé sur un milieu liquide ou solide.
4-Techniques générales de culture L’ensemencement,

1. Cultures en milieux liquides

a-Culture à partir d’un prélèvement liquide

L’öse flambée et refroidie est introduite aseptiquement dans le prélèvement puis enfoncée
stérilement dans le milieu à ensemencer.

b-Culture à partir d’un prélèvement en milieu solide

Après avoir chargé l’öse de semence, elle est introduite dans le tube à ensemencer, amenée
juste au contact du liquide ; gratter l’anse la paroi du tube afin d’obtenir une suspension
épaisse et bien homogène, celle-ci est ensuite mélangée à la totalité du milieu de culture.
Après ensemencement, le bouillon est incubé à 37°C. Après 24 à 48heures d’incubation, observer
la présence ou l’absence d’un dépôt, son aspect, sa couleur ainsi que la présence d’un voile.

2. Cultures en milieux solides

a-Culture en tubes Milieux solidifiés inclinés –

Ensemencement en stries transversales A partir de 0.5 – 1cm du bas de la pente, décrire avec
l’öse chargée de semence des stries parallèles et serrées sur la gélose sans l’érailler. Sans
stériliser l’öse, refaire l’opération dans deux autres tubes. Incuber 24 – 48h à 37°C. Il y a
également des ensemencements sur pente : en nappe, en touches, en strie médiane. Milieux en
culot - Ensemencement en piqûre Le fil métallique (platine ou nichrome) parfaitement droit et
chargé de semence sert à faire une piqûre centrale. Le tube est ensuite incubé 24 – 48h à 37°C
5-Partie pratique

A - MATÉRIEL

* Coffret "Institut Pasteur" : tubes 1 (bacilles = Enterobacter cloacae) et 2 (streptocoques

Streptococcus fœcalis), C1 et C2 (bouillon nutritif), D1 et D2 (gélose nutritive).

* Galerie, pipettes Pasteur, öses bouclées, becs Bunsen.

Remarque : on peut acheter le bouillon nutritif et la gélose nutritive dans le commerce, ou

même la fabriquer soi-même (voir annexes). On peut également se procurer les souches de
bactéries dans un laboratoire d'analyses biologiques et médicales

B - PRÉPARATION DES TUBES DE MILIEU LIQUIDE

* Débloquer les bouchons des tubes 1 et 2 (bacilles et streptocoques).

* Casser l'extrémité d'une pipette Pasteur et la passer rapidement à la flamme

 * Déboucher le tube 1 (bacilles) et prélever stérilement une goutte de liquide avec la pipette
Pasteur.

* Passer rapidement l'ouverture du tube 1 à la flamme avant de le refermer.

* Ouvrir le tube C1 de bouillon nutritif et déposer la goutte prélevée dans le tube 1.

 * Passer l'ouverture du tube C1 à la flamme avant de le refermer sans serrer le bouchon.

* Recommencer toutes ces opérations avec les tubes 2 (streptocoques) et C2.

C - Préparation des tubes de milieu solide

* Les tubes D1 et D2 ont été préalablement fondus puis refroidis inclinés.

* Passer une öse bouclée à la flamme, puis prélever l'inoculum dans le tube 1.

* Passer l'ouverture du tube 1 à la flamme avant de le refermer.

* Ouvrir le tube D1 et l'ensemencer en stries ascendantes (schéma). Le refermer sans serrer.

* Recommencer toutes ces opérations avec les tubes 2 et D2.

* Tous les tubes C1, C2, D1 et D2 sont mis à l'étuve (18 à 24 h à 37°C ou 3 jours à 20°C
TECHNIQUE DU TRANSFERT A L'ÖSE

Le tube de départ est saisi de la main gauche entre pouce et index. L'öse est saisie de la
main droite, comme un crayon, stérilisée à la flamme et refroidie dans la zone de stérilité du
bec Bunsen. Le tube de départ est présenté, orifice vers la zone de protection, et est débouché
à l'aide du petit doigt de la main tenant l'öse.

L'orifice du tube et le bouchon doivent rester dans la zone de protection et ne toucher aucun
objet. On flambe l'orifice du tube pour détruire les germes pouvant s'y trouver. L'öse est alors
introduite dans le tube sans toucher les bords.

Le prélèvement est effectué soit par grattage d'une colonie à l'aide de la boucle (sans abîmer
la gélose), soit par trempage de la seule boucle dans un milieu liquide. L'öse est ensuite retirée
sans toucher les parois ; le bord du tube est à nouveau flambé et le bouchon remis. Pendant
cette opération, l'öse chargée de germes ne doit ni sortir de la zone stérile, ni pénétrer dans la
flamme du bec.

L'opération est renouvelée avec le tube d'ensemencement vierge qui est débouché et dans

lequel on fait pénétrer l'öse.

- S'il s'agit d'un milieu liquide, la boucle est agitée légèrement en surface du milieu en raclant
les bords du tube pour bien libérer et répartir l'inoculum.

- S'il s'agit d'une gélose inclinée, la boucle va se poser au fond du tube, à la surface de la
gélose et l'inoculum est déposé en stries ascendantes régulières sans rayer la gélose.