TP N° 3 - Techniques d’ensemencement

Objectifs :
Afin de pouvoir identifier une espèce bactérienne de façon convenable, il faut faire des tests
ou des expériences dessus. Il est souvent utile d’avoir une quantité importante de bactéries.
Pour cela, on multiplie la souche en réalisant des ensemencements sur une gélose ou dans un
milieu liquide adapté.

1. Ensemencement d’un bouillon

L’utilisation d’un bouillon permet une pousse rapide et homogène des bactéries. Cependant,
il a des désavantages. En effet, s’il y a plusieurs espèces bactériennes dans un prélèvement ou
une contamination extérieure, il est impossible de différencier les différentes espèces
bactériennes puisque les cellules se trouvent en milieu liquide donc mélangées…
La technique d’ensemencement d’un bouillon est par contre très simple :

- Stériliser l’instrument servant à prendre la souche bactérienne d’origine (pipette dans

le cas de bouillon, anse dans le cas d’une colonie)
- Prélever la souche à ensemencer
- Stériliser l’ouverture du flacon de bouillon stérile
- Ensemencer le bouillon à l’aide du prélèvement effectué précédemment
- Re-stériliser l’ouverture du flacon de bouillon
- Stériliser l’instrument

Il ne reste plus qu’à incuber dans les conditions optimales

2.Technique du transfert à l'öse

Le tube de départ est saisi de la main gauche entre pouce et index. L'öse est saisie de la
main droite, comme un crayon, stérilisée à la flamme et refroidie dans la zone de stérilité du
bec Bunsen. Le tube de départ est présenté, orifice vers la zone de protection, et est débouché
à l'aide du petit doigt de la main tenant l'öse.

L'orifice du tube et le bouchon doivent rester dans la zone de protection et ne toucher aucun
objet. On flambe l'orifice du tube pour détruire les germes pouvant s'y trouver. L'öse est alors
introduite dans le tube sans toucher les bords.

Le prélèvement est effectué soit par grattage d'une colonie à l'aide de la boucle (sans abîmer
la gélose), soit par trempage de la seule boucle dans un milieu liquide. L'öse est ensuite retirée
sans toucher les parois ; le bord du tube est à nouveau flambé et le bouchon remis. Pendant
cette opération, l'öse chargée de germes ne doit ni sortir de la zone stérile, ni pénétrer dans la
flamme du bec.

L'opération est renouvelée avec le tube d'ensemencement vierge qui est débouché et dans
lequel on fait pénétrer l'öse.

- S'il s'agit d'un milieu liquide, la boucle est agitée légèrement en surface du milieu en raclant
les bords du tube pour bien libérer et répartir l'inoculum.

- S'il s'agit d'une gélose inclinée, la boucle va se poser au fond du tube, à la surface de la
gélose et l'inoculum est déposé en stries ascendantes régulières sans rayer la gélose.