Vous êtes sur la page 1sur 43

KHALAFAT KARIM

1- Nature des eaux


• Eaux brutes (superficielle ou profonde)
• Eau livrée à la consommation
• Eau utilisée dans un traitement , glace
alimentaire
• Eaux minérales naturelles
Les eaux brutes

Eaux non traitées


Eaux traitées

Eau ayant subi un traitement physique et une désinfection


Eau ayant subi un traitement physique, un traitment chimique et une
désinfection
Eau ayant subi un traitement physique, un traitement chimique , un
affinage et une désinfection

Les schémas d’analyse dépendent du type d’eau considéré


I- Prélèvement à un robinet , chez
l’usager
• Les brise-jets ou tuyaux de caoutchouc doivent
être supprimés.
• L’orifice de sortie est flambé énergiquement
après 5 minutes au moins de débit et le
prélèvement est réalisé aseptiquement par
méthode classique après refroidissement 5
minutes par l’eau
II- Préparation des dilutions décimales

L’eau

Eau Eau physiologique


physiologique
Eau physiologique

Les dilutions sont effectuées en cascades à partir de la


solution mère 10-1.
III-Méthodes d’analyse quantitative

 Dénombrement des germes de contamination


fécale
Coliformes totaux et fécaux
Sterptocoques fécaux ou les Enterococcus
des spores de bactéries anaérobies et de

Clostridium sulfitoréducteurs
 Recherche des germes pathogènes : 
Les salmonelles
Les staphylocoques
Vibrio
 Dénombrement des germes aérobies mésophiles
1. Dénombrement des germes de contamination
fécale:

1.1 la colimétrie: ou les coliformes totaux et fécaux


Principe de dénombrement:

• Les propriétés qu’ont les coliformes à fermenter le


lactose à 30 - 37°C (et à 44°C pour les Coliformes
fécaux) avec production d’acide et de gaz en
présence de sels biliaires, sont utilisées dans les
milieux de culture pour leur recherche et leur
dénombrement.
 Le coliforme est une entérobactérie fermentant le lactose à
30°C avec production de gaz.
 On distingue les coliformes totaux (à 30 et 37°C ),
les coliformes thermo tolérants (fécaux) qui fermentent
le lactose à 44 °C.
 Les coliformes sont recherchés dans les eaux car ils
sont de bons marqueurs de contamination fécale

E.coli
Principaux Milieux de Culture pour la recherche des Coliformes
Totaux et Fécaux :

Milieux liquides La composition

vert brillant avec • Le vert brillant et la


Bouillon lactosé bile
bilié au cloche • Les substrats carbonés
« BLBVB » sont le lactose et des
peptones
• Les substrats carbonés
Bouillon Lactosé sont le lactose, les
au Pourpre de peptones et la viande de
Bromo Crésol bœuf
« BCPL » • Indicateur de pH: le
pourpre de bromocrésol

Le dénombrement se fera donc selon la table de Mac Grady.


- Principe :

Pour les dé tecter, il existe diverses procédures dont


l'utilisation du bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol
(BCPL) :
fermentation du
lactose et
substrats carbonés du virage de l’indicateur
lactose et des peptones

un indicateur de pH : apparition de bulles


le pourpre de dans la cloche de
bromocrésol, Durham

-Technique :
A partir de chaque dilution décimale on porte aseptiquement 1ml dans les
tubes de BCPL et on incube à 37°C pendant (18à 24) heures.
Cette méthode est dite pré somptive
2- test de confirmation ou test de Mac-Kenzie:
la recherche des coliformes fécaux
formation
Principe Technique: Résultat positif:
d'un
anneau
rouge
utiliser la Pour chaque tube
propriété d’ E.coli positif on
de produire de ensemence:
-1ml, dans un tube
l’indole et de de BCPL, incubation
fermenter le 24h a 44°C,
lactose à 44°C. la
-1ml dans une eau production
peptoné exempte d'indole
d'indole + 3 ou 5
gouttes du réactif
de Kovacs.
Milieux solides La composition

• le désoxycolate,
Gélose au Désoxycholate inhibiteur des
à 1 %° ou gélose VRBL bactéries Gram +
• indicateur de pH: le
rouge neutre

Gélose Lactosée au • le tergitol 7


Tergitol TTC

Le dénombrement se fera donc par comptage des UFC.


Un test de confirmation est suivi d’un test de présomption si les
résultats sont positifs:

 Test de confirmation:

Il se fait sans dénombrement préalable des


coliformes par la même technique en milieu solide,
mais avec étuvage à 44°C.

Incubation à 44C
pendant 24h
1-2- recherche des streptocoques fécaux:
 Les streptocoques fécaux sont des bactéries
appartenant à la famille des Streptococcaceae

 lls sont des témoins de contamination fécale assez résistant y


compris dans les milieux salés (GAUJOUS, 1995). Ils peuvent
aussi se multiplier dans les milieux présentant des pH allant
jusqu'à 9.6, on peut par conséquent les utiliser comme
indicateurs d'organismes pathogènes qui ont une résistance
similaire au pH élevé (PNUE/OMS, 1977).
Test d'enrichissement Agent sélectif : Résultat positif
Milieu Rothe  azide N Trouble bactérien
37°C pdt 24h
Test de confirmation deux agents sélectifs Résultat positif
le milieu Litsky. l’azide et l’éthyl-violet Présence d’une pastille
37°C pdt 24h Violette au fond du
tube
1.2 les Enteroccuocus:

Milieu d’enrichissement: Rothe Milieu Litsky

Azide N-3 Azide et


l’éthyl-violet

Trouble homogène et
Louche microbien
une pastille violette au
fond de tube
 Test présomptif:

• Préparer dans un portoir, une série de tubes


contenant le milieu Rothe à raison de deux tubes
par dilution.

• A partir des dilutions décimales 10-1 à 10-4,


porter aseptiquement 1 ml dans chacun des deux
tubes correspondant à une dilution donnée.
 Test de confirmation:

Les tubes de ROTHE trouvés positifs lors du


dénombrement des STREPTOCOQUE feront l’objet d’un
repiquage à l’aide d’une anse bouclée dans un tube
contenant le milieu Litsky.
1-3- Recherche des clostridium sulfito-
reducteur
- Principe :
Les clostridium sont des bactéries sporulé es sulfito-
ré ducteurs fermentent le lactose avec production de gaz.
Leur recherche se base sur la croissance sur un milieu
sélectif muni de sodium et d’alun de fer, qu’il est réalisé
sur la gélose VF.
Les clostridium ré duisent les sulfites de sodium en
sulfites de fer.

Clostridium botulinum
La Les
4. recherche
germes et le dénombrement
anaérobies sulfito- des
anaérobies sulfito-réducteurs
réducteurs: sont réalisés sans
deux buts différents:

Clostridium perfringens de type A est


recherché car parfois responsable d’intoxications
alimentaires.

Les Clostridium sulfito-réducteurs


« ou leurs spores » sont des bons indices de
contamination fécales, éventuellement ancienne
vu la résistance des spores à l’exteriuer.
Technique

Préparation de
l’échantillon
Résultats -- Résultat +

Régénérée la gélose
VF par ébullition au
bain-marie bouillant placer ensuite le
pendant environ 30 tube à l'étuve (à
minutes. 37°C) pendant 24
-Ensemencer lorsque heures.
le milieu est encore
liquide, vers 45°C. et
chargée

Lecture :
La présence des clostridium solfito-réducteurs est mise en évidence
par l’apparition des colonies entourées d’un halo noir, le résultat est
présenté par le nombre de spores dans 1ml de produit.
2. la recherche des germes pathogènes :
2.1 Recherche des salmonelles :

principe de dénombrement:

Le nombre de Salmonella étant en général


faible dans le produit, il est nécessaire de
procéder à un préenrichissement et à un
enrichissement dans un milieu sélectif.
L’isolement des Salmonella est ensuite réalisé
sur d’es milieux sélectifs classiques ;SS, DCL,
DCLS, Hektoen, gélose RP et VB…
*Elles appartiennent à la famille des enterobacteriacés
et sont des bâtonnets mobiles, Gram (-), aérobies et
facultativement anaérobies.
* Elles fermentent le glucose, le maltose et le mannitol, avec
production de gaz, Elles réduisent le sulfite en sulfure et
decarboxylent la lysine.

*Elles sont peut être la cause la plus fréquente d'infections


des êtres humains par des organismes pathogènes à hôte
animal (PNUE/OMS, 1977)
Milieux d’enrichissement Milieux d’isolement

Bouillon au sélénite La gélose SS

Bouillon de Kauffman La gélose DCL et


au tétrathionate DCLS

Bouillon au vert
La gélose Hektoen
malachite et au
chlorure de magnésium
Mode opératoire :

La recherche et le dénombrement des germes


revivifiables se réalise en procédant à un pré-
enrichissement et à un enrichissement.

• Jour 1 : Pré-enrichissement:


Le pré-enrichissement consiste a introduire 1ml de
solution mère dans un tube a vise contenant le milieu BLMT
qui sera incubé à 37°C pendant 18 à 24 heures.

• Jour 2 : Enrichissement:


Ce dernier consiste à introduire 1 ml du milieu BLMT
préalablement ensemencé dans un tube qui contient le milieu
SFB , qui sera incubé à son tour à 37°C pendant 18 à 24
heures.

• Jour 3 : Isolement:


Chaque tube fera l’objet d’un isolement sur le milieu
gélosé Hektoen
Lecture :
Les Salmonella se présentent de la façon suivante :
- colonies le plus souvent grise bleue à centre noir sur gélose
Hektoen.

Milieu Hektoen avant Milieu Hektoen après


ensemencement ensemencement
2.2 Recherche de Staphylococcus aureus :

principe de dénombrement:

le dénombrement des Staphylococcus aureus


est réalisé grâce à des milieux sélectifs.
Un volume précis de produit est étalé sur un
milieu sélectif solide « Chapman ou surtout Baird
Parker »
>Staphylocoques aureus:
*Le staphylocoque doré est l'espèce la plus
pathogène du genre Staphylococcus.
Elle est responsable d'intoxications alimentaires,
d'infections localisées suppuré es, et dans certains cas
extrêmes, de septicémies chez des sujets débilités.
*S. aureus se présente comme un coque en amas,
Gram positif, catalase positif et coagulase positive.
Bouillon de
Milieu Chapman Baird Parker
Chapman

le Na Cl a haute • Tellurite « dont la Chlorure de sodium


concentration réduction en tellure en grande quantité
noir sert
d’indicateur »
• Ion lithium
Colonies jaunes Trouble homogène
« mannitol+ » Colonies noires,
avec un halo clair
A partir des dilutions décimales 10-1 à 10-3,
porter aseptiquement 1 ml de chaque dilution
réparti en surface dans deux boites contenant le
milieu de Baird Parker, Faire ensuite des
mouvements circulaires et de va-et-vient en
forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de se
mélanger à la gélose utilisée.
Pour l’isolement : Chapman solide :
permettant la croissance
des germes halophiles.

Ensemencement Sélectivité Caractères


recherchés

massif, en stries fortes fermentation du


serrées ou par concentrations en mannitol par virage
inondation chlorure de sodium au jaune de
(75 g.L-1) l’indicateur coloré,

Résultat

des colonies pigmentées


en jaunes et mannitol +
  S. aureus

avant utilisation après utilisation


cette analyse qui concerne les vibrions du choléra V. cholerae ne
s’effectue que dans des cas très precis (épidémies) et doit être
réservée à des laboratoires spécialisés.

Les principaux milieux utilisés pour la recherche des vibrio sont:

• OMS GN à pH 8 additionné
• Wilson Blair et Heard de 1% de taurocholate
de sodium

Milieux d’enrichissement Milieu d’isolement

37°C pendant 6 à 7 h 37°C pendant 24 à 48 h


Pseudomonas aeruginosa
• Cette bactérie est de plus recherchée, en
particulier pour le contrôle des eaux
conditionnées . On peut réaliser un
dénombrement en milieu liquide ou solide
(généralement par filtration) en utilisant les
milieux par exemple la gélose cétrimide.
• Un enrichissement peut se faire sur bouillon à
l’acétamide ou sur bouillon de Schubert au vert
brillant et à l’arginine pendant 24 heures à 37°C.
La FMAT est un indicateur d'hygiène
important. En effet, elle permet d'évaluer le
nombre d'UFC (Unité Formant colonie) présente
dans un produit ou sur une surface. Le
dénombrement se fait à 30°C pendant 72 h
Mode opératoire:
• A partir des dilutions décimales allant de
10-1 à 10-3, porter aseptiquement 1 ml
dans une boite de Pétri contenant la
gélose PCA « Plate Count Agar »
• repartir dans les boites en fusant forme
de 8  pour permettre à l’inoculum de se
mélanger à la gélose utilisée.

• Incubation :

Les boites seront incubées couvercle


à 30°C pendant 72 heures avec :
- première lecture à 24 heures,
- deuxième lecture à 48 heures, et
- troisième lecture à 72 heures.
Lecture :
Les colonies des F A M T se présentent sous forme lenticulaire en
masse.
5- Recherche et dénombrement des levures et des
moisissures:
La flore mésophile fongique:
 Les champignons inferieurs prolifèrent sur des
milieux acides et provoquent des altérations
nutritionnelles et organoleptiques.
Leur dénombrement permet d'estimer l'efficacité du
traitement thermique et l'état de conservation

Saccharomyces cerevisiae
Principe:
Le milieu sélectif utilisé doit renfermer une substance
inhibant le développement des bactéries.
Ce milieu est la gélose glucosé à
l’oxytétracycline (OGA).
Technique :
On étale 0.1ml de la suspension mère et des dilutions décimales
de produit à analyser sur la surface de la boite de pétri contenant le
milieu sélectif (OGA) ; et l’incubation se fait à 25°C pendant 5jours
Les moisissures se présentent
en colonies ayant un aspect Résultats
velouté
Les levures se
présentent en
colonies semblables
à celles des bactéries
mais plus brillantes
et rondes.
Normes et textes réglementaires
• Limites de qualité des eaux destinées à la
consommation humaine
• Absence de samonella dans 5 lites,
• Absence d’autres germes pathogènes
• Absence de staphylocoques dans 100ml
• Absence de bactériophages fécaux dans 50 ml
• Absence de coliformes thermotolérants et de
streptocoques fécaux dans 100ml
• Germes anaérobies sulfito-reducteurs < 1/20ml
• 95% au moins des échantillons prélevés ne
doivent pas contenir de coliformes dans 100ml.