Université Elhadj Lakhdar Batna 1 2023/2024

Institut des Sciences Vétérinaires et des Sciences Agronomiques

Département de Science Agronomique (L2)
Module : Microbiologie Générale

TD 2 : Méthode d’Etude et d’Analyse de la Cellule Bactérienne

Définition de la Stérilisation :
La stérilisation est une opération qui vise à détruire tous les micro-organismes
d'un objet de façon durable. Elle est notamment utilisée dans la cuisine, la médecine et l'industrie
pharmaceutique (médicaments). L'objectif de la stérilisation est double :
contrôler les micro-organismes et prévenir une éventuelle contamination.

I. Stérilisation par les Méthodes Physiques (TP)

II. Stérilisation par les Agents Chimiques

La stérilisation chimique (souvent appelée "stérilisation à froid"). Si des objets doivent être stérilisés,
mais que l'utilisation de la vapeur à haute pression ou de la stérilisation à la chaleur sèche les
endommagerait ou que l'équipement n'est pas disponible (ou opérationnel), ils peuvent être stérilisés
chimiquement. Certains désinfectants de haut niveau tuent les endospores après une exposition
prolongée (10-24 heures). Les désinfectants courants qui peuvent être utilisés pour la stérilisation
chimique comprennent les glutaraldéhydes et le formaldéhyde.

Définition de la désinfection :
C’est l’élimination des formes végétatives des microorganismes sans ou peu d’effets sur les spores
bactériennes. Pour ce faire, des produits chimiques sont utilisés, généralement pour la désinfection des
salles et plans de travail et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés. Elle
s’effectue grâce aux :
➢ Antiseptiques = toxicité modérée (utilisés sur les tissus vivants ; exp: alcool à 70°, solutions
iodées, eau iosinée, lotions,…)

Définition des Antiseptiques

Sont des substances anti-bactériennes non spécifiques agissant globalement et rapidement sur les
bactéries, virus, champignons et spores, ils sont réservés à l'usage externe car il est toxique par voie
générale. Pour une souche donnée, l’antiseptique peut être :
• Bactéricide : destruction des bactéries
• Bactériostatique : inhibition de la multiplication des bactéries
• Fongicide : destruction des champignons
• Fongistatique : inhibition de la multiplication des champignons
• Virucide : destruction des virus
• Sporicide : destruction des spores bactériennes

Dr. Labiba Kahalerras

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➢ Désinfectants = toxicité élevée (utilisés sur les substances inertes ; exemple : dérivés chlorés
(eau de Javel), dérivés phénoliques, Formol,…). Selon l’état physique, il existe :

1. Les désinfectants liquides :

L’éthanol : pour la désinfection des paillasses et des instruments.

L’hypochlorite de sodium (eau de Javel) : utilisé dilué au ¼ dans les bacs destinés à recevoir
les lames utilisées, ou en pissette pour la désinfection des paillasses et des sols.
Les savons et les détergents
2. Les désinfectants gazeux :

Formol : la vapeur d’une solution chauffée de formol est utilisée pour désinfecter les pièces et
les étuves. L’ammoniac aussi peut être utilisé en combinaison pour diminuer la toxicité des
vapeurs.

L’oxyde d’éthylène : en industrie, il est utilisé pour la désinfection de certains matériaux en

plastique à usage unique.

Tableau 4 : Exemples de quelques antiseptiques les plus utilisés.

SPECIALITES INDICATIONS
LES POLYVIDONES IODES (PVPI) OU HALLOGENES IODES
PVPI scrub - Désinfection des mains
Savon antiseptique - Douche pré-opératoire
- Détersion peau saine, peau lésée, muqueuses
- Antisepsie peau saine, peau lésée et muqueuses
PVPI alcoolique - Antisepsie peau saine
- Manipulations (robinets rampes, sac à urine.)
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PVPI ORL -Antisepsie de la sphère ORL

LES BIGUANIDES (CHLORHEXIDINE)
Savon antiseptique
Solution alcoolique
chlorhexidine + chlorure de
benzalkonium +alcool
benzylique
LES ALCOOLS (ETHANOL)
Alcool modifié 70°
Dakin ou autre
- Désinfection des mains
- Douche pré-opératoire
- Détersion peau saine peau lésée
- Antisepsie peau saine en 1 temps
- Antisepsie peau saine
- Manipulations (robinets rampes, vidange de sac à
Urine.)
- Produit de référence pour l’enfant de moins d’un
mois
- Antisepsie peau saine et peau lésée
- Antisepsie peau saine en 1 temps
- Manipulations (robinets rampes, vidange de sac à
urine.)
Les CHLORES
-Antisepsie peau saine peau lésée et muqueuses
- Préconisé sur les muqueuses en cas d’intolérance à
l’iode
- Irrigations
- Avec précaution pour l’antisepsie des cavités
Internes

Tableau 5 : Résumé des activités de quelques désinfectants

Virus de
Staphylococcus grippe
C. difficile Salmonella HIV
Tuberculose Virus de la Moisissures
Streptococcus E. coli Varicelle-
(Bacilles) gastroentérite levures
Enterococcus Pseudomonas Zona
Listeria Rougeole
rubéole
Hypochlorite
de sodium
+ + + + + +
(eau de
Javel)
Peroxyde
d’hydrogène + + + + + +
activé

Phénols + + +/- +/- + +/-

Ammoniums
quaternaires + +/- +/- +/- +/- +

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III- Moyen d’étude d’une Cellule Bactérienne

1- Fractionnement des Bactéries
Les bactéries peuvent être lysées par :
1-1 - des procédés physiques : broyage en présence de microbilles de verre, d’ultrasons, de
variation de pression ;
1-2 - des procédés chimiques : digestion enzymatique, action d’antibiotiques, action de détergents.
Les différents constituants bactériens, lorsqu’ils sont libérés, peuvent être séparés par gel filtration,
centrifugation différentielle, électrophorèse.

2- Observation des Bactéries

2-1- Microscopie optique : L’examen à l’état frais, entre lame et lamelle, renseigne sur la forme
des bactéries et leur mobilité éventuelle. L’examen après coloration permet de mieux apprécier leur
forme.
2-2- Microscopie Electronique Elle permet l’étude de la structure fine des bactéries.

IV- Méthode d’étude d’une Cellule Bactérienne

1- Préparation des Echantillons :
1-1- Prélèvement des Bactéries :
Prélèvement des échantillons bactériens doit se faire stérilement, pour le réaliser il faut :
- Une zone stérile : créée à l’aide du Bec bunsen
- Outils de prélèvement : anse, anse de platine, pipette pasteur, écouvillon….

- L’échantillon prélevé doit être cultivé que ce soit sur boite de Pétri contenant milieu de culture solide
(gélose) ou sur un tube à essai contenant milieu de culture liquide (Bouillon)

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2- Incubation des échantillons : l’incubation se fait à une température et une durée optimale de
croissance de la bactérie. Ces conditions sont assurées au laboratoire à l’aide de l’étude.

3- L’identification des bactéries

3-1- Observation macroscopique : (description des colonies) :
L’aspect des colonies dépend du milieu, de la durée et la température d’incubation. Il ne pourra être
décrit convenablement qu’à partir des colonies bien isolées. La description des colonies doit mentionner
plusieurs éléments :
- La taille : petite, moyenne ou grande ;
- La forme : bombée, plate, ombiliquée, à centre surélevé ;
- L’aspect de la surface : lisse, rugueux, muqueux ;
- L’opacité : opaque, translucide, transparent ;
- La consistance : grasse, crémeuse, sèche, muqueuse ;
- Pigmentation (la couleur)
3-2- Observation microscopique
Compte tenu de leur taille (de l'ordre du micron), les bactéries sont visualisées au microscope optique
sans coloration (état frais) ou après coloration.
3-2-1- Observation à l’état frais :
C’est l’examen microscopique des micro-organismes vivants. Ce type d’observation permet
d’apprécier :
➢ La mobilité des bactéries et leur morphologie ;
3-2-2- Observation après coloration :
L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame (frottis bactérien)
et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées sur des frottis sèches et fixes,
sont classées en :
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➢ Coloration simple (un seul colorant) : La coloration au bleu de méthylène peut apporter des
informations concernant la morphologie des germes.
➢ Coloration différentielle ou double type Gram ;
➢ Colorations spéciales des structures bactériennes (capsules, spores.).

3-3- La recherche des Caractères Biochimiques :

L'identification biochimique des bactéries est effectuée en utilisant des milieux de culture dont la
composition permet de mettre en évidence une enzymatique.
Exemples : l’identification par Api système : activités variables (souches A et B) de type ß-
galactosidase (ONPG), lysine décarboxylase (LDC), ornithine décarboxylase (ODC), uréase (URE)

L'activité fermentaire est révélée avec un milieu type contenant un sucre, un indicateur coloré des
changements de pH. La fermentation du sucre entraîne un abaissement du pH et donc un changement de
couleur de l'indicateur coloré.

Dr. Labiba Kahalerras