DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION

BACTERIENNE
Compte Rendu TP de MICROBIOLOGIE

2eme année de Pharmacie

Groupe : 2
Réaliser par :
FATOUAKI Ilyas FIHRI Youssef

CHERRADI Abdsabbour ELANTAK Abdelhakim

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 SOMMAIRE
SECTION 1 : -> INTRODUCTION

SECTION 2 : -> BUTS DES MANIPULATIONS

SECTION 3 : -> MATÉRIELS

SECTION D : -> EXAMENS MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE D'UN

BOUILLON DE BACTÉRIES:
D.1 EXAMEN MACROSCOPIQUE

D.2 EXAMEN MICROSCOPIQUE (ETAT FRAIS ET FROTTIS COLORÉ)

SECTION E : -> BAAR

SECTION F : -> LES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE

F.1 MHS ou Mueller Hinton

F.2 Mac Conkey

F.3 Chocolat polyvitex

F.4 Chapman

F.5 CLED

F.6 KLIGLER HAJNA :

SECTION G : -> PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES

STAPHYLOCOQUES:
G.1 TESTS D’IDENTIFICATIONS

SECTION H : -> PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES BGNS

H.1 TEST D’OXYDASE
H.2 TEST DE KIGLER
H.3 LECTURE DE LA GALLERIE
H.4 CONCLUSION
SECTION I : -> ANTIBIOGRAMME

SECTION J : -> CONCLUSION

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 INTRODUCTION

Lorsqu’il s’agit d’une maladie infectieuse, on a recours à des examens biologiques qui
permettent l’identification de microorganismes de façon directe (examen macroscopique,
microscopique, mises en culture) ou indirectement (par recherche d'anticorps spécifiques d'un
microorganisme). Les principaux types de tests comprennent les suivants :

• Microscopie
• Culture
• Tests immunologiques (tests d'agglutination comme l'agglutination au latex, les dosages
immunoenzymatiques et réactions de fixation du complément)
• Méthodes d'identification basées sur les acides nucléiques
• Méthodes d'identification non basées sur les acides nucléiques
Or la microscopie et la culture sont, les principaux tests de référence, réalisés lors du TP.

Tout d’abord, il est important d’examiner le produit pathologique macroscopiquement pour

avoir une hypothèse sur l’infection puis microscopiquement à l’état frais, afin de pouvoir
détecter la mobilité des germes infectieux, ainsi que leurs caractères morphologiques qui vont
nous orienter vers un diagnostique précis.

Ensuite vient le tour de la fixation et de la coloration. On utilise la coloration de Gram. C’est une
coloration qui différencie entre les bactéries à gram + et celles à gram -, et permet donc de
choisir le milieu approprié au germe que l’on cherche à identifier.
L’étape qui suit correspond à la mise en culture de la bactérie dans un milieu qui assure sa
croissance seule (un milieu sélectif). Il existe de nombreux types de milieux sélectifs comme le
Mac Conkey pour les bacilles à gram-, le CNA pour les Cocci à gram+…

L’incubation pendant 18 à 24h à 37°C donne lieu à des colonies dont la taille, la forme, la
couleur, la surface, l’aspect et le contour renseignent plus sur le germe infectieux, et guident
dans le choix des tests d’identification. Si l’on suspecte des Entérocoques par exemple, il
conviendrait de réaliser un test à la catalase. Le choix du test se fait en fonction de la bactérie
suspectée suite aux résultats des observations et de la mise en culture.

Une fois le germe identifié, il est d’utilité de connaitre son profil de résistance à un certain
nombre d’antibiotiques. Et pour cela on réalise un antibiogramme par méthode de diffusion
par exemple. A la fin de cette étape, il devient possible d’établir la liste des antibiotiques pour
lesquels la bactérie est sensible et donc ceux qui peuvent être utilisés chez le patient atteint de
l’infection, ce qui est enfin du compte, le but qu’on cherche à atteindre.

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 BUTS DES MANIPULATIONS
Se familiariser avec un laboratoire de microbiologie, son équipement et son
fonctionnement
- Présentation des gros matériels (étuves, autoclave,…)

- Présentation du poste de travail : Matériels (bec bunsen, pipettes, verres, béchers

anse, pinces lame,...), Produits (eau, alcool, colorants de Gram, BM, Ziehl)

- Démonstration à partir d’un bouillon de culture contenant un mélange de

bactéries.

-Réaliser un Examen macroscopique et un Examen microscopique (Etat frais au

microscope (X40) /Confection d’un frottis /Coloration de Gram

-Présentation de la coloration de Ziehl Neelsen et observation d’un frottis déjà

Préparé

-Présentation des milieux de culture : solides, liquides

-Ensemencement sur milieux gélosés

- Démonstration observation et suivi des isolements :

-Noter l’aspect des colonies (taille, forme, couleur, hémolyse)

-Coloration de Gram sur chaque type de colonies.

-Réalisation de tests catalase, Pastorex, coagulase

-Réalisation d’une suspension à partir des colonies

-Ensemencement d'une galerie d'identification + Kligler +Contrôle de pureté

Réalisation d’antibiogrammes.

- Lecture et interprétation des galeries d'identification, Kligler et des

Antibiogrammes.

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 MATERIELS
étuve

pipettes

verres

béchers et anse

pinces

lames

lamelles

microscope optique

Bloc de paraffine

Plaque chauffante

colorants et fixateur(Gram)

les différents milieux de culture utilisés lors du TP

tubes à essai

du plasma, H2O2, d’autres réactifs…

une galerie API

disques d'antibiotiques

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EXAMENS MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE
D'UN BOUILLON DE BACTÉRIES:
Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de
bactéries, de signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle
présence de leucocytes, notamment de polynucléaires. Ces éléments
peuvent entrainer au delà d'un seuil, une modification visuelle,
clairement perceptible à l'œil nu, qui signe une anomalie patente.
Divers éléments peuvent être signe d’une infection : Trouble au
niveau du LCR, Hématurie, odeur ou consistance.
I. EXAMEN MACROSCOPIQUE :
On observe macroscopiquement un trouble au niveau du produit
pathologique ce qui signifie qu’il y a une infection bactérienne et
nous guide vers l’examen microscopique pour détecter et identifier
l’espèce bactérienne.

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 II. EXAMEN MICROSCOPIQUE:
1) Examen à l’état frais :
a)Préparation de la lame :
Au moyen d’une pipette Pasteur, prélever une goutte de culture en
bouillon et la déposer au centre d’une lame de verre (on choisit la
face à extrémité rugueuse pour se repérer et pour éviter la coloration
ou l’observation de la face qui ne contient pas de bactéries), la
pipette est jetée dans l’eau de javel. Ensuite, Recouvrir la goutte
d'une lamelle couvre objet en évitant d’enfermer des bulles d’air (la
culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle, pour
permettre une bonne observation). Notre lame est par la suite luttée
avec de la paraffine fondue. (La paraffine va permettre de fixer la
lame).

b) Observation au Microscope optique :

Allumer et régler la lumière pour obtenir une lumière homogène à
travers l'oculaire. Puis, déposer la préparation microscopique (lame
mince) au centre de la platine, en la fixant à l'aide des valets. On
ajuste les objectifs (pour l’examen à l’état frais, on choisit l’objectif
x40 qui va nous donner un grossissement de x400).Ensuite, on ajuste
les vis macrométrique et micrométrique jusqu’à obtenir une image
nette. Une fois la mise au point effectuée, on observe la lame et on
note les résultats, puis on jette la lame dans l’eau de javel.

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Résultats : l’examen à l’état frais nous permet d’observer la
morphologie et la mobilité des bactéries. On observe à partir de la
lame préparée à l’état frais, des bactéries très nombreuses les unes
sous forme arrondie (les Cocci) et d’autres sous forme allongée (les
bacilles) et qui sont immobiles (ne nagent pas et vibrent à leur place).

2- Examen sur frottis fixé et coloré :

a- Confection de frottis:
Au moyen d’une anse , déposer une goutte de bouillon au
centre d'une lame de verre ,Etaler la goutte sur un cercle de
façon à obtenir un étalement mince puis Fixer le frottis en
Laisser sécher sur une plaque chauffante (ne dépassant pas
les 45 C° pour ne pas altérer les bactéries)
RQ: On n’a pas utilisé la flamme du bec Bunsen ni pour
stériliser d'anse ni pour la fixation du le frottis.

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b- Coloration de gram:
Recouvrir la lame de violet de gentiane phéniqué
phéniqué et laisser agir
une minute, Rincer rapidement à l'eau du robinet et éliminer
l'excès d’eau, Recouvrir la lame de Lugol (permet de fixer
cette coloration interne et laisser agir une minute Rincer à
l'eau du robinet et éliminer l'excès d'eau. Ensuite, Différencier
(décolorer) avec un mélange alcool -acétone ne ("Différenciateur
rapide"). Ce temps est le plus délicat de la coloration de Gram.
Gram
Rincer abondamment à l'eau du robinet. Recouvrir la lame de
fuchsine de Ziehl 1/10 et laisser agir une minute, Rincer à l'eau
du robinet, Sécher puis observer au microscope
microscope (objectif x100 à
immersion).

N.B: Avant observation au microscope optique,

on ajoute une goutte d’huile d’immersion sur la lame. On utilise
l’huile pour augmenter la résolution et voir nettement la lame
(diminuer la déviation des rayons).

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Résultats:
Les bactéries gram négatif (BGN)
apparaissent
Roses (Des bacilles).
Les bactéries gram positif (BGP)
apparaissent
Violettes (Des Cocci en amas).

3) LES BACTÉRIES ACIDO-ALCOOLO

ACIDO ALCOOLO RESISTANTES (BAAR):
on Recouvre la lame de Fuchsine de Ziehl
Ziehl puis on Chauffe jusqu'à émission de
vapeurs blanches ,Laisser refroidir environ trois minutes, Répéter deux fois le
chauffage si bien que dans un temps de l'ordre de 10 minutes la lame aura été
chauffée trois fois. Ensuite ,Rincer à l'eau du robinet puis,
puis, Recouvrir la lame
d'acide sulfurique au 1/4 et laisser agir une minute ,Rincer à l'eau du robinet ,
Recouvrir la lame d'alcool à 95° et laisser agir une minute, Rincer à l'eau du
robinet ,Recouvrir la lame avec une solution diluée de bleu de méthylène et e
laisser agir deux minutes ,Rincer à l'eau du robinet et Sécher puis observer au
microscope (objectif x100 à immersion).

Observation :

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Milieu de culture:
Le milieu Löwenstein-Jensen est un milieu
sélectif à base d’œuf spécialement utilisé pour
la culture et l’isolement des espèces de
Mycobacterium, notamment Mycobacterium
tuberculosis à partir d’échantillons cliniques. La
sélectivité de ce milieu est basée sur la
présence de vert de malachite et de sels
minéraux qui inhibent la plupart des
organismes contaminants. La culture des
mycobactéries est favorisée par les substances
nutritives apportées, entre autres, par l'œuf et les oligoéléments.

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 LES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE
M.H.S OU MUELLER HINTON : est une gélose
riche pour la réalisation de l’antibiogramme
standard (non sélective). Composition :
infusion de viande de bœuf, peptone de
caséine, amidon de maïs, agar, pH = 7,4.

Mac Conkey : est un milieu sélectif et différentiel utilisé

pour l'isolement et la différenciation de bacilles à Gram
négatif non exigeants, en particulier les membres de la
famille des entérobactéries.

◈ La sélectivité : Le colorant violet cristal et les sels

biliaires arrêtent la croissance des bactéries gram-positives.
Cela permet uniquement aux espèces gram-négatives, qui
ont une membrane externe relativement résistante à la bile,
de former des colonies sur gélose MacConkey

◈ La différenciation : Les bactéries Gram-négatives qui

poussent sur MacConkey se différencient par leur capacité à
fermenter le lactose. Les bactéries qui fermentent le
lactose = le rouge neutre, les bactéries quine fermentent
pas le lactose apparaissent incolores sur le milieu

Chocolat polyvitex : est un milieu d’isolement non sélectif,

utilisé pour la culture de bactéries exigeantes. Au cours de
sa préparation, l’hémoglobine contenue dans ce milieu lui
donne pendant un temps une teinte rouge. La couleur du
milieu vire ensuite au marron après l’autoclavage. Couleur
qui lui vaut son nom de « gélose chocolat ».Pour convenir
à la culture des bactéries exigeantes, un supplément
polyvitaminique est introduit au cours de sa préparation.
Le nom de ce supplément varie selon les fabricants, il se
nomme par exemple « polyvitex » ; Ainsi l’hémoglobine
apporte le facteur X (hémine) et le polyvitex apporte le
facteur V (NAD) nécessaires, tous les deux, à la culture
d’Haemophilus influenzae.

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 Chapman : est un milieu de culture sélectif et différentiel
employé en microbiologie pour la culture des bactéries
halophiles et halotolérantes.

◈ Lasélectivité de ce milieu est basée sur la présence

de chlorures de sodium (7.5%) qui inhibe la plupart des
bactéries à Gram négatif et à Gram positif.

◈ La différenciation est basée sur la capacité à fermenter

ou non le mannitol (le seul sucre du milieu). S'il y a
fermentation, cela induit une acidification qui entraîne, à
des niveaux de PH inférieurs à 6.9, une coloration jaune
du milieu en présence de rouge de phénol (indicateur
de PH).

CLED : (Cystine Lactose Electrolyte Deficient ) est un

milieu de culture différentielle, non inhibiteur, utilisée
pour l’isolement, la numération et la différenciation des
micro-organismes urinaires. Le milieu contient de
la cystine, du lactose, du bleu de bromothymol et
est déficient en électrolytes.

• La cystine est ajoutée au profit des organismes qui

ont un besoin spécifique en cystine. Elle favorise la
croissance des coliformes.
• Le lactose est inclus pour fournir une source
d'énergie aux organismes capables de l'utiliser par
un mécanisme de fermentation.
• Le bleu de bromothymol est l'indicateur utilisé dans
la gélose, il vire au jaune en cas de production
d'acide lors de la fermentation du lactose ou vire au
bleu foncé en cas d'alcalinisation. Les bactéries
lactose-positives forment des colonies jaunes. Les
bactéries qui décarboxylent la L-cystine provoquent
une réaction alcaline et forment des colonies bleu
foncé
• La déficience en électrolytes réduit l’envahissement
du milieu par les Proteus.

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KLIGLER HAJNA : est un milieu de culture permettant la
recherche simultanée de : pour notre culture on a obtenu
• L'utilisation du lactose (pente jaune :
bactérie lactose +)
• La fermentation du glucose (culot jaune :
bactérie glucose +)
• La production d'H₂S (absence de précipité noir)
• La production de gaz (La production de gaz lors de
l'utilisation des glucides est mise en évidence par le
décollement de la gélose et/ou des bulles dans la
gélose.

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 PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES

Pour identifier les Cocci gram positif présentés dans le milieu

Mueller Hinton, on commence par un test catalase qui nous permet
de différencier les différents types de bactéries (Staphylocoque,
Entérocoque, Streptocoque), puis on passe au test de coagulase qui
sert à identifier les Staphylocoques aureus des autres espèces.
1. Test catalase :
-Principe :
En présence d'oxygène moléculaire, certaines réactions métaboliques conduisent à
la formation d'eau oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade l'eau
oxygénée en eau et oxygène.

-Lecture :
On observe la formation de bulles d’air alors la réaction est positive
Donc on peut dire que cette bactérie est une Staphylocoque

2. Test coagulase :
-Principe :
Le test de la coagulase différencie les souches de Staphylocoque aureus des autres
espèces à coagulase négative (SCN).

-Lecture :
On observe la formation d’un caillot de fibrine alors le résultat est positif
Donc on peut dire que cette bactérie est un Staphylocoque aureus

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 PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES BGNS
Pour identifier les bacilles gram négatif présentent dans le milieu MAC
CONKEY, on passe par plusieurs étapes :

1. Test oxydase :
-Principe :
Ce test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder
un réactif incolore (la NN-diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé
-Lecture :
Pas de réaction, résultat négatif, alors on peut dire que la bactérie est un
bacille gram négatif fermentaire

2. Milieu Kligler Hajna :

-Principe :
Ce test consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie à fermenter le lactose
et le glucose et aussi la production d’H2S et du gaz.

-Lecture :
On observe une utilisation du glucose car il y a apparition de couleur jaunâtre,
et la fermentation du lactose avec production de gaz mais sans production de
H2S.

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 3. Galerie API
La galerie API est un test formé d’un ensemble de cupules prêtes à l’emploi
permettant l’identification de micro-organismes par la réalisation facile et rapide de
tests biochimiques miniaturisés.

Avant Incubation

Après Incubation

Après Ajout de révélateur sur TDA et IND

MICROBIOLOGIE Page 18
 -Lecture :

4. CONCLUSION :
D’après la galerie API 10S, on a pu identifier la bactérie à travers le code obtenu, le
nom de la bactérie est Klebsiella pneumoniae ssp pneumniae

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 ANTIBIOGRAMME
Définition :
L’antibiogramme est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou plusieurs
antibiotiques par la technique de diffusion sur milieux gélosé. Il a pour but de guider le
clinicien dans le choix d’un antibiotique pour traiter une infection bactérienne, d’exploitées
les données pour la surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques.
Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-
Hinton (plus 5% de sang pour les germes exigeants):

• Il montre une reproductibilité de lot à lot acceptable pour les tests de

sensibilité.
• Il est faible en inhibiteurs qui affectent les résultats des tests de sensibilité au
sulfonamide, au triméthoprime et à la tétracycline.
• Il favorise une croissance satisfaisante de la plupart des agents pathogènes.
• Un grand nombre de données et d'expérience ont été collectées sur les tests
de sensibilité effectués avec ce milieu.

Les disques d’antibiotiques sont fabriqués à partir de papier absorbant de qualité

supérieure imprégnés d’agents antimicrobiens à des concentrations précises. Ils
comportent 1 à 3 lettres, imprimé de chaque côté du disque.

La suspension cellulaire doit être préparée dans de l’eau physiologique stérile à partir d’une
culture jeune et pure sur milieu d’isolement approprié. Elle doit être ajustée par comparaison avec
un étalon d'opacité (0 ,5 Mc Farland). L’ensemencement doit se faire avec des stries serrées. On
dépose les disques d’antibiotique sur la gélose, puis on applique une légère pression avec une
pince ou une aiguille stérile sur les disques pour assurer un contact complet du disque avec la
gélose (certains distributeurs le font automatiquement) :

• Pour les staphylococcus aureus : •Pour les entérobactéries :

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CONCLUSION D’ANTIBIOGRAMME :

Pour le Staphylococcus aureus, on sait que le Staphylococcus aureus est sensible

pour la méthyciline et c’est le cas pour notre antibiogramme et donc ce résultat nous
permet de confirmer le résultat de l’identification par test de catalase et coagulase.

Pour l’Entérobactérie, on sait que Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae est

résistante à l’Ampicilline, et donc nous confirmons aussi le résultat de l’identification
par galerie d’API.

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 CONCLUSION
Un diagnostic bactérien à pour but final, identifier les bactéries présentes dans un
produit pathologique. Après plusieurs test d’identification et mise en culture, on a
accomplie le but du diagnostic, et on a identifié une Cocci gram positif qui est un
Staphylocoque aureus et un bacille gram négatif fermentaire qui est Klebsiella
pneumoniae ssp pneumoniae.

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