Spécialité: Contrôle de qualité.

Semestre: 02
Module: Microbiologie.

Techniques générales d'identification

Plan:

II.1. Introduction.
II.2. Caractère d'identification.
II.2.1. Caractères culturaux et morphologiques.
a. Étude macroscopique.
a.1. Sur milieu liquide.
a.2. Sur milieu solide.
b. Étude microscopique.
b.1. Forme et mode de groupement.
b.2. Paroi.
b.3. Mobilité.
b.4. Capsule.
b.5. Endospore.
II.2.2. Caractères biochimiques.
a. Métabolisme énergétique et respiratoire.
a.1. Identification des types respiratoires.
a.2. Identification du métabolisme fermentaire et oxydatif.
a.3. Identification de la respiration anaérobie.
- Respiration Nitrate.
- Respiration sulfate.
a.4. Identification des enzymes respiratoires.
- Oxydase.
- Catalase.
b. Métabolisme glucidique.
b.1. Utilisation des milieux simples.
b.2. Utilisation des milieux complexes.
- Milieu TSI.
- Milieu KIA.
b.3. Mise en évidence de l'esculine (test esculine).
 b.4. Mise en évidence de l'ONPG hydrolase (test ONPG).
b.5. Mise en évidence de la dégradation du Mannitol (Test mannitol
mobilité).
b.6. Mise en évidence de la dégradation du Citrate (Test citrate de
Simmons).
b.7. Mise en évidence des types fermentaires.
- Fermentation mixte (test rouge méthyle).
- Fermentation butanodiolique (test de voges-proskauer)
c. Métabolisme protéique.
c.1. Mise en évidence de la dégradation de la lysine, ornithine et arginine
(LDC, ODC, ADH).
c.2. Mise en évidence de la dégradation du tryptophane.
c.3. Mise en évidence de la dégradation de l'urée.
d. Métabolisme lipidique.
II.2.3. Caractères physiologiques.
a. Température.
b. pH.
c. Pression osmotique.
II.2.4. Caractères du pouvoir pathogène.

Préparé par : Mme LAGHA Nadia.

II.1. Introduction:
L'identification d'un microorganisme ne peut avoir lieu que lorsqu'il a été isolé à l'état pur,
l'identification consiste en la détermination des différents caractères d'un microorganisme
en vu de le classer.

II.2. Caractère d'identification:

II.2.1. Caractères culturaux et morphologiques:

Un caractère cultural est caractère qui est déterminé après avoir effectué une culture du
germe à étudier, la culture obtenue peut être étudié de plusieurs manières à savoir:

a. Étude macroscopique:
a.1. Sur milieu liquide:
Dans un milieu liquide, nous pouvons déterminer à la fois, la zone de culture (en surface ou
en profondeur), son aspect général. Les cas suivant peuvent être déterminé:

Culot Trouble Anneau Voile

Figure n°1: Caractères culturaux obtenu sur milieu liquide.

a.2. Sur milieu solide: Lorsque l'étude se fait sur milieu incliné, les cas obtenus sont:

Envahissante Filiforme Ondulée Diffuse Arborescente

Figure n°2: Caractères culturaux sur milieu solide incliné.

L'étude des caractères culturaux en milieu solide se fait aussi sur gélose en boite pétri, il
s'agit d'étudier les colonies bien séparées, on détermine alors: la forme, la couleur, l'aspect
...

Ces observations peuvent se faire à l'œil nu ou bien à l'aide d'une loupe.

 Figure n°3: Types de colonies obtenues sur gélose en boite Pétri.

b. Étude microscopique:
Dans ce cas, afin de déterminer les caractères suivants, il est nécessaire d'utiliser un
microscope optique et quelques méthodes de coloration.

b.1. Forme et mode de groupement:

Ces deux caractères sont très important dans l'identification des bactéries, leur mise en
évidence reste très simple, il s'agit tout simplement de méthodes microscopiques, l'état
frais, coloration simple, coloration de Gram...

Figure n° 4: Formes et modes de groupement bactérien.

b.2. Paroi: (vu en s 1).

b.3. Mobilité:
Il existe plusieurs méthodes afin de déterminer la présence ou l'absence du flagelle, le choix
de la méthode se fait selon les besoins recherchés:
  Détermination de la mobilité sur le milieu Mannitol-mobilité (voir partie métabolisme
biochimique).
 Détermination de la mobilité à l'aide de méthodes microscopiques par coloration.

Méthode:
 Préparation du frotti: (ce dernier exige beaucoup de soins en raison de la fragilité
des flagelles)
- Prendre une lame propre et sèche.
- Prélever à partir d'une culture jeune sur gélose (pipette Pasteur boutonnée).
- Plonger la pipette dans 1 ml d'eau distillée stérile et laisser les bactéries se séparer d'elles
mêmes jusqu'a l'obtention d'une suspension légèrement opalescente.
- Déposer à une extrémité de la lame deux gouttes de la suspension.
- Incliner la lame et laisser les deux gouttes s'écouler sur toute la longueur de la lame.
- Laisser sécher, ne pas fixer.

 Coloration par la méthode de Leifson:

- Recouvrir la lame de colorant de Leifson, laisser agir 10 minutes.
- Laver directement à l'eau distillée et sécher.

Résultat:
- Les cellules bactériennes apparaissent colorées en rouge vif, les flagelles en rouge ou rose.

b.4. Capsule:

C'est une structure facultative avec un contour délimité et une consistance visqueuse.

Méthode: (Appelée méthode de l'état frais à l'encre de chine).

- Déposer une goutte de la suspension à étudier et une goutte d'encre de chine au centre de
la lame.
- Recouvrir d'une lamelle.
- Observer au microscope.

Résultats:
Les capsules se présentent sous forme de halos clairs qui enveloppent les cellules
bactériennes qui sont colorées en gris foncé.

b.5. Endospore:

Méthode:
- Les spores apparaissent souvent comme des zones incolores dans des bactéries colorées au
bleu de méthylène ou avec d'autres colorants simples, les spores sont imperméables a la
plus part des colorants.
- Des colorants spéciaux sont utilisés pour les rendre visibles, tel que le procédé de Schaffer-
Fulton:
- Les endospores sont d'abord colorées par chauffage des bactéries avec du vert de
Malachite, un colorant très puissant qui pénètre dans l'endospore, ensuite les cellules sont
lavées avec de lui puis contre colorées par la safranine.

Résultats:
L'endospore apparait verte dans une cellule (sporange) orange.
II.2.2. Caractères biochimiques:

a. Métabolisme énergétique et respiratoire:

a.1. Identification des types respiratoires:

Principe:
Utilisation de gélose profonde, afin d'obtenir un gradient de concentration d'oxygène qui
permet le développement des quatre types respiratoires.

Le gradient de concentration d'oxygène signifie que dans un tube de gélose profonde, on

retrouve toutes les concentrations d'oxygène, de la concentration nulle à la concentration
atmosphérique.

Le tableau suivant détaille les besoins en oxygène selon le type respiratoires:

Type respiratoire: Besoins en Oxygène: Effet de l'oxygène:

Aérobie stricte Présence (concentration Vital.

atmosphérique).

Anaérobie stricte Absence (concentration Toxique.

nulle).

Aéro-anaérobie facultative Présence/Absence (Toutes Aucun effet.

concentrations confondues).

Micro-aérophile Présence (Faible Vital (Faible concentration).

concentration).

Méthode:
Pour étudier les différents types respiratoires, on utilise une gélose profonde du type VF
(Viande-Foie), repartie en tube en passant par les étapes suivantes:

- Faire fondre la gélose a 100°C au bain Marie puis refroidir a 45°C.

- Remplir quatre tubes à essai jusqu'au en haut.
- Remettre les tubes au bain Marie à 100°C, les bouchons dévissés pendant 20 minutes.
Cette étape permet de chasser les bulles d'oxygène introduites lors du remplissage des tubes
qui peuvent fausser les résultats.
En effet, si l'oxygène introduit n'est pas éliminer, il permettra le développement des colonies
aérobies strictes en profondeur, ce qui est contre le principe même de la méthode.
- Revisser les bouchons des tubes remplis et laisser refroidir jusqu'à 45°C.
- Ensemencer la gélose avec une pipette boutonnée en faisant une spirale de bas en haut en
faisant très attention a ne pas introduire de l'air. Cette technique (ensemencement en
spirale) permet de distribuer le germe sur toute la hauteur du tube de manière homogène.
- Incuber à 37°C pendant 24 à 48h.
Résultat:

Aérobie stricte Anaérobie stricte Aéro-anaérobie stricte Micro-aérophile

Figure n°5: Résultats obtenus par la mise en évidence des types respiratoires.

a.2. Identification du métabolisme fermentaire et oxydatif:

Principe:
Les bactéries dégradent le glucose soit par oxydation (cycle de Krebs) ou bien par
fermentation, les deux métabolismes engendrent l'accumulation des acides dans le milieu.

Il s'agit d'utiliser une gélose en culot qui contient le glucose comme seule source de carbone
et un indicateur coloré (rouge phénol) sensible aux variations du pH. C'est le milieu MEVAG
(Milieu d'étude des voies d'attaque du glucose) qui réunit toutes les conditions nécessaires
pour identifier le métabolisme oxydatif ou fermentaire.

Méthode:
Ensemencer à la fois deux tubes du milieu MEVAG par piqure centrale.
Recouvrir un tube avec de l'huile de paraffine ou de vaseline (1cm).
Incuber à 37°C pendant 24/48h.

Résultat:
Après incubation, les résultats possibles sont:

 Métabolisme oxydatif:
Apparition d'un virage au jaune dans la partie supérieure du tube sans paraffine.

 Métabolisme fermentaire:
Virage au jaune des deux tubes de MEVAG ou bien Virage de la totalité du tube avec
paraffine et virage au jaune de la partie inférieure du tube sans paraffine.

 Métabolisme inerte:
Aucun changement dans les deux tubes.

Ou

Métabolisme Fermentaire Métabolisme oxydatif Métabolisme inerte

Figure n°6: Identification du métabolisme respiratoire.

a.3. Identification de la respiration anaérobie:
 Respiration Nitrate:
Il s'agit de mettre en évidence la réduction des nitrates en nitrites (réduction partielle), puis
parfois en di-azote (réduction complète).

NO3- + 2H+ + 2é NO2- + H2O (réduction partielle)

NO3- + 6H+ + 5é 1/2 N2 +3 H2O (réduction complète)

La mise en évidence de ces réactions nécessite l'utilisation d'un milieu enrichi en nitrate,
dans le quel s'effectue la culture, d'un réactif appelé réactif de Greiss qui vire au rouge en
présence des nitrites, L'apparition de cette teinte dans le milieu signe la présence d'ions
nitrites. Cela signifie que la bactérie possède une nitrate réductase et que cette dernière est
capable de réduire les nitrates jusqu'au stade nitrites, et la poudre de zinc qui réduit les
nitrates en nitrites pour démontrer la réduction totale des nitrates.

Remarque:
Réactif de Greiss + Nitrite = teinte rouge.
Poudre de Zinc + Nitrate = teinte rouge.

Méthode:
Ensemencer un tube de bouillon nitrate et incuber à 37°C pendant 24/48h.

Résultat:
Après obtention d'une culture bien visible, ajouter deux gouttes du réactif de Greiss ou une
goutte du réactif Nitrites 1 (acide sulfanilique) et une autre goutte du réactif Nitrites 2 (α-
naphtylamine) (Le réactif de Greiss est un mélange des réactifs nitrites 1 et 2).

Apparition d'une teinte rouge qui signifie qu'il y a présence de nitrite, donc le nitrate du
milieu a été réduit, on conclut que les bactéries ensemencées sont Nitrate réductase
positive (réduction partielle).

Aucun changement dans le milieu, donc absence de nitrite, dans ce cas on s'expose a deux
situations:
- Soit le nitrate n'a pas été réduit, il n ya donc pas de nitrate réductase,
- Soit le nitrate a été réduit jusqu'au stade de di-azote (une réduction totale).

Pour faire la différence entre ces deux situations et déterminer dans quel cas nous sommes,
il faut alors ajouter de la poudre de zinc.

Milieu rouge : présence de nitrate dans le milieu → la bactérie ne possède pas l’enzyme.
Coloration jaune : pas de nitrate dans le milieu → la bactérie possède l’enzyme au stade N2.

Ensemencement+incubation
37°C/24 à 48h

Bouillon Nitrate
 Deux gouttes du réactif de
Greiss ou une goutte du R1
et R2.

Poudre de Zinc

Apparition de la couleur rouge Aucun changement

Présence de Nitrite (NR+) Absence de Nitrite

Apparition de la couleur rouge Aucun changement

Présence de Nitrate (NR-) Absence de Nitrate (NR+)

Figure n°7: Identification de la Nitrate réductase.

 Respiration sulfate:
Les microorganismes anaérobies utilisant les sulfates (SO42-) comme accepteur
d'électron final, en le réduisant en sulfure d'hydrogène (H2S), sont appelés microorganismes
sulfito-réducteur.

Méthode:
La mise en évidence de ces bactéries nécessite des milieux de culture contenant des
composés soufrés (sulfate ou sulfite ou autre) et du Fer, Ce dernier qui en présence de
sulfure d'Hydrogène donne une coloration noir.
Il existe plusieurs milieux permettant l'identification de la réduction des sulfates qui sont:
- Milieu VF additionné d'ampoule d'alun de fer et d'une ampoule de sulfite de Sodium (revoir
le point a.1. Identification des types respiratoires)
- Milieu TSI et Milieu KIA (Voir le point.....

Résultat:
Apparition de tache noire autour de la colonie qui est composée de bactéries sulfito-
réductrices.

a.4. Identification des enzymes respiratoires:

 Oxydase:
Une oxydase est une enzyme catalysant une réaction d'oxydo-réduction impliquant une
molécule de dioxygène (O2) comme accepteur d'électron. Dans ces réactions, l'oxygène est
réduit en eau (H2O) ou en peroxyde d'hydrogène (H2O2).
Le terme d'oxydase désigne une enzyme recherchée en bactériologie systématique. On dit
qu'une bactérie est oxydase + si un fragment de culture est capable d'oxyder la forme
réduite de dérivés N-méthylés du paraphénylènediamine en semi-quinone (rose violacé).

Méthode:
- Placer un disque oxydase non imprégné sur une lame en verre à l'aide d'une pince flambée.
- Déposer une goutte du réactif oxydase sur le disque.
- A l'aide d'une pipette Pasteur, prélever une colonie à partir d'une gélose nutritive et la
déposer sur le disque.

REMARQUE:
La colonie ne doit pas être prélevée par une anse métallique qui pourrait être recouvert par
un oxyde et donner un résultat faussement positif.
Le milieu utilisé ne doit pas contenir un indicateur de pH, ni un glucide.

Résultat:
Attendre 30 secondes et observer:
- Pas de changement, oxydase négative (la bactérie ne contient pas d'oxydase).
- Apparition d'une couleur rose violacé, oxydase positive (la bactérie contient une oxydase).

Figure n° 8: Mise en évidence de l'oxydase.

 Catalase:
Il s'agit d'une oxydoréductase qui est capable de décomposer le peroxyde d'hydrogène en
eau de l'oxygène. En se basant sur cette réaction que la catalase est mise en évidence au
laboratoire.

Méthode:
- Déposer sur une lame propre et sèche une goutte de peroxyde d'hydrogène.
- Prélever une colonie à l'aide d'une pipette Pasteur ou une anse de platine.
- Déposer la colonie sur la goutte de peroxyde d'hydrogène.

Résultat:
- Apparition de bulles qui indiquent la libération d'oxygène, la bactérie possède une catalase
(catalase+).
- Aucun changement, la bactérie n'est pas capable de décomposer le peroxyde d'hydrogène,
bactérie ne possédant pas de catalase (catalase-).
 Figure n° 9: Mise en évidence de la catalase.

b. Métabolisme glucidique:
b.1. Utilisation des milieux simples:
Un milieu simple est un milieu ne contenant qu'un seul glucide, en général le glucose. Parmi
les milieux simples les plus fréquemment utilisés, le MEVAG (voir a.2.).
b.2. Utilisation des milieux complexes:
Un milieu complexe est un milieu qui contient plusieurs sucres à la fois, les milieux étudiés
dans cette partie sont le milieu TSI et le milieu KIA.
 Milieu TSI:
La gélose TSI (Triple Sugar Iron) permet une mise en évidence:
- La fermentation du lactose, du glucose (avec ou sans production de gaz), du saccharose
grâce au rouge phénol qui change de couleur suivant le pH.
- La production de sulfure d’hydrogène grâce a la présence de Fer dans la composition du
milieu.
La fermentation des sucres produit la libération d'acides organiques dans le milieu, leur
accumulation fait baisser le pH, le rendant ainsi acide ce qui fait virer la couleur de
l'indicateur coloré (le rouge phénol) au jaune.
Le sulfure d'hydrogène libéré dans le milieu se combine avec le Fer et donne une coloration
noire.
Méthode:
Ensemencer un tube de TSI à l’aide de stries serrées sur la pente suivies d’une piqûre
centrale dans le culot, ne jamais fermer la vis à fond.
Incuber à 37°C pendant 24/48h.
Résultats:
1- Fermentation de glucose :
• Culot rouge : glucose non fermenté.
• Culot jaune : glucose fermenté.
2- Fermentation du lactose et/ou du saccharose :
• Pente inclinée rouge : lactose et saccharose non fermentés.
• Pente inclinée jaune : lactose et/ou saccharose fermenté(s).
3- Production de gaz :
• Apparition de gaz dans le culot.
4- Formation d’H2S :
• Formation d’une coloration noire entre le culot et la pente ou le long de la piqûre.
 Milieu KIA:
La gélose KIA est différente du milieu TSI par l'absence du saccharose.
b.3. Mise en évidence de l'esculine (test esculine):
La gélose esculine permet de mettre en évidence l'hydrolyse de l'esculine par l'esculinase (β
glucosidase). L'esculine est un hétéroside formé d'un glucide complexe qui peut être
dégradé par l'esculinase. Les produits de la réaction sont le glucose et l'esculétine, cette
dernière peut réagir avec les ions Fer pour donner un précipité noir.

Méthode:
Ensemencer un tube de gélose à esculine par piqure centrale et incuber a 37°C pendant 24 à
48 heures.

Résultats:
Apparition de précipité noir dans la gélose qui signifie que les ions Fer se sont combinés avec
l'esculétine, donc l'esculine a été dégradé: présence d'esculinase (esculinase +).
Aucun changement, l'esculine n'a pas été dégradé: absence d'esculinase (esculinase-).

b.4. Mise en évidence de l'ONPG hydrolase (test ONPG):

L'orthonitrophényl-β-galactoside est un hétéroside, dont l'aglycone est
l'orthonitrophénol (ONP) et la partie glucidique est constituée par un galactose.

L'ONPG est incolore. Son hydrolyse par une β-galactosidase libère du galactose et de
l'orthonitrophénol (ONP), composé de couleur jaune en milieu alcalin.

Ce test est réalisé lors de l’identification de très nombreuses bactéries (Gram + et Gram -). La
-galactosidase est une enzyme qui intervient dans le métabolisme du lactose. L’utilisation
du lactose par la bactérie requiert deux enzymes :
 La lactose perméase qui permet au lactose de pénétrer dans la bactérie
 La -galactosidase qui catalyse l’hydrolyse du lactose en glucose et galactose.

La recherche de la -galactosidase ne présente d’intérêt que pour les bactéries lactose -. En

effet, toutes les bactéries lactose + sont -galactosidase +. La recherche de l’enzyme est
donc inutile.

On utilise un substrat synthétique : l’ortho-nitro-phényl-galactoside (= ONPG) incolore, de

structure proche du lactose et capable de pénétrer dans la bactérie sans perméase.
 Si la bactérie possède la -galactosidase, on obtient du galactose et de l’orthonitro-
phénol (= ONP) de couleur jaune.

La réaction est la suivante :

ONPG ONP + galactose

Méthode:
Ce test doit être effectué à partir d’une souche lactose - cultivée dans un milieu contenant
du lactose.
- Faire une suspension dense en eau stérile (tube à hémolyse).
- Déposer un ½ disque d’ONPG.
- Placer au bain-marie à 37°C.
- Lire après 30 minutes.
Résultats:
Apparition de la couleur jaune, libération de l'ONP, donc la bactérie ONPG+.
Aucun changement, pas de réaction, donc la bactérie est ONPG-.

b.5. Mise en évidence de la dégradation du Mannitol (Test mannitol mobilité):

Le mannitol (C6H14O6) est un polyol (« sucre-alcool ») ; c'est un produit similaire au xylitol ou
au sorbitol. Le Milieu Mannitol-mobilité est un milieu faiblement gélosé, contenant une
concentration de mannitol comme source de glucide et le rouge phénol comme indicateur
coloré.

Méthode:
- Ensemencer au moyen d'un fil de platine ou une pipette Pasteur boutonnée par piqure
centrale jusqu'au fond du milieu.

- Incuber à 37°C pendant 24 heures.

Résultats:
Le mannitol est fermenté: le milieu vire au jaune. Dans le cas contraire, le milieu garde sa
couleur.

Si la bactérie est immobile, on observe des colonies au lieu de l’ensemencement, par contre
si la bactérie est mobile on observe une répartition des colonies dans le milieu.

b.6. Mise en évidence de la dégradation du Citrate (Test citrate de Simmons):

Ce test permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate comme seule source de carbone
et d'énergie. Seules les bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc
capables d'utiliser le citrate et pourront se cultiver sur ce milieu Citrate de Simmons,
l’utilisation de citrate provoque l’alcalinisation du milieu.

Méthode:
Ensemencer un tube de Citrate de Simmons par des stries sur toute la partie inclinée et
incuber à 37°C.

Résultat:
Si les bactéries ensemencées sont capables de dégradées le Citrate, le milieu devient alcalin
ce qui fait viré le Bleu de Bromothymol du vert (milieu acide) au bleu (milieu alcalin).

b.7. Mise en évidence des types fermentaires:

Les tests RM et VP permettent l'étude des produits de fermentation du glucose :
différenciation entre les fermentations « acides mixtes » et « butylène glycolique ».

Méthodes:
Il s'agit en premier lieu d'ensemencer un tube du milieu Clark et Lubs et incuber pendant
24/48 à 37°C.

Ce milieu permet de rechercher les voies fermentaires des bactéries et de différencier la

fermentation des acides mixtes et la fermentation butanediolique, il est caractérisé par sa
composition riche en glucose.

Le milieu précédemment divisé en deux tubes stériles, afin d'effectuer les tests suivants:
- Test RM (rouge méthyle):
Prendre un des deux tubes du milieu Clark et Lubs et y ajouter quelque gouttes du rouge
méthyle. Le résultat apparait en quelques secondes.

C’est une réaction utilisée pour mettre en évidence la voie fermentative des acides mixtes
lors de l’identification des bactéries. La fermentation du glucose par les bactéries produit de
l’acide pyruvique, puis des acides organiques. Ces acides font virer le RM au rouge et dans le
cas contraire, il vire au jaune.

- Test VP (Voges Proskauer):

Ce test permet la mise en évidence de la production d'acétoïne (ou 3-hydroxybutanone) au
cours de la fermentation butylène glycolique. Le milieu Clark et Lubs est ensemencé et
incubé à 35-37°C pendant 48h. En présence d'a-naphtol (0.5 ml de VP1) et d'une base forte
(soude ou potasse) (1 ml de VP2), l'acétoïne donne une coloration rouge en milieu très
oxygéné.

c. Métabolisme protéique:

c.1. Mise en évidence de la dégradation de la lysine, ornithine et arginine (LDC, ODC, ADH):
Les bactéries peuvent assimiler et dégrader les acides aminés selon deux voies
métaboliques: La désamination et la décarboxylation.

La désamination :
Elle est réalisée par des désaminases bactériennes, c’est le départ du groupement aminé.
Les désaminases, enzymes induites, agissent sur les acides aminés en entraînant la
formation des acides cétoniques correspondants, selon la réaction suivante :

R CH COOH R CO COOH + NH3

NH2

Acide amine Désaminases Acide cétonique

La décarboxylation :
Elle est réalisée par des décarboxylases bactériennes, enzymes induites qui libèrent le
groupement carboxyle et forme l’amine correspondante suivant cette réaction :

R CH COOH R CH2 NH2 + CO2

NH2

Acide aminé Décarboxylases Amine

La recherche des décarboxylases de l’ornithine, de la lysine, et de l’arginine forment trois

tests biochimiques utiles dans le diagnostic différentié des bactéries. Ces trois tests peuvent
être réalisés sur les bouillons « LDC- ODC- ADH » qui sont appelés les milieux de Moëller et
qui permettent de montrer la présence des décarboxylases et dihydrolase bactériennes par
la mise en évidence de l’acidification du milieu et sa réalcalinisation.

Le milieu d’étude contient du glucose, l’indicateur coloré et l’acide aminé. Chez les bactéries
la fermentation du glucose entraîne une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthèse
de l’enzyme ; l’alcalinité due à l’amine entraîne ensuite le virage de l’indicateur au violet
après une courte phase de jaunissement. Si la bactérie étudiée ne possède pas de
décarboxylases, le milieu restera acide, donc jaune.

- L’ornithine décarboxylase (ODC) est une enzyme qui libère le groupement carboxyle de
l’acide aminé ornithine et donne production de la putriscine qui alcalinise le milieu.

- La lysine décarboxylase (LDC) est une enzyme qui libère le groupement carboxyle de l’acide
aminé lysine et donne production de la cadavérine qui alcalinise le milieu.

- L’arginine dihydrolase (ADH) est une enzyme qui dégrade l’arginine en libérant de
l’ammoniac et des amines qui alcalinisent le milieu. Il existe des acides aminés qui peuvent
être décomposés selon des réactions métaboliques particulières, comme le cas du
tryptophane.

Méthodes:
Ensemencer trois tubes ODC, LDC et ADH par la même souche et incuber pendant 24 heures
(on peut ajouter de l'huile de paraffine ou de vaseline afin d'avoir des conditions
d'anaérobiose).

Résultats:
Au départ le milieu vire au jaune puisque les bactéries ensemencées fermentent le glucose
ce qui acidifie le milieu, après épuisement du glucose, les décarboxylases rentrent en jeu, ce
qui alcalinise le milieu et qui fait virer le pourpre de Bromocrésol au violet.

c.2. Mise en évidence de la dégradation du tryptophane (test indole):

Certaines bactéries dégradent le tryptophane grâce à une tryptophanase en formant de
l’indole, de l’acide pyruvique et de l’ammoniac. L’indole peut être mis en évidence en
utilisant le milieu urée-indole ou L’eau peptonée exempte d’indole ; c’est un bouillon qui ne
contient pas d’indole, mais il contient du tryptophane pour que les bactéries puissent le
dégrader en indole.

Méthode:
Ensemencer le bouillon d'eau peptonée exempte d'indole et ensemencer à 37°C pendant 24
heures.

Résultat:
Au moment de la lecture ajouter quelques gouttes du réactif de Kovacs. Le diméthyl-amino-
4-benzaldéhyde contenu dans le réactif de Kovacs réagit avec l'indole, et forme un composé
coloré en rouge en surface du bouillon (anneau rouge).

c.3. Mise en évidence de la dégradation de l'urée:

Les entérobactéries peuvent dégrader l’urée qui est un composé organique et qui peut servir
de source d’azote unique aux bactéries possédant une uréase. En présence de cette enzyme,
les bactéries uréolytiques peuvent décomposer l’urée en carbonate d’ammonium qui
alcalinise le milieu, et qui fait virer l’indicateur coloré de pH (le rouge de phénol) du jaune au
rouge en milieu basique.
Méthode:
Le milieu Urée-indole permet d’étudier simultanément les deux caractères, d’une part, la
production d’indole à partir de tryptophane et d’autre part, la production de l’uréase. Ce
milieu liquide est réparti en tubes à hémolyse.
Ensemencer le bouillon puis incuber à 37°C.

Résultat:
Virage du bouillon au rouge dû à l'alcalinisation du pH, ce qui signifie que l'urée à été
dégradé.

d. Métabolisme lipidique:
Son étude permet d'explorer l'activité lipolytique des micro-organismes.
En microbiologie alimentaire : les micro-organismes ayant une activité lipolytique peuvent
proliférer dans les aliments riches en lait et dérivés, viandes et être à l'origine
d'altérations de ces aliments.
Pour se faire, on utilise une gélose ordinaire additionnée d'émulsion de jaune d'œuf, puisque
ce dernier contient:
Des lécithines qui sont des phospholipides pouvant être hydrolysé par une lécithinase.
Des triglycérides pouvant être hydrolysés par une lipase.
Une lipoprotéine pouvant être hydrolysée par une lipoprotéase.

Méthode:
Ensemencement d'une boite pétri en spot puis incubation à 37°C pendant 24 heures.
Résultat:
Vérification de la zone autour des colonies obtenues:
Lécithinase positive: elle se traduit par une opacification par rupture de l'émulsion.
Lipase positive: elle se traduit par une opacité floue due aux cristaux d'acides gras.
Protéase positive: elle se traduit par un halo d'éclaircissement.

II.2.3. Caractères physiologiques:

a. Température:
Il s'agit, de faire une culture bactérienne sur un bouillon nutritif ou un bouillon non séléctif
sur trois tubes avec la même souche puis les incuber chacun aux températures suivantes:
15°C, 37°C, 45°C pendant 48 heures.

Le tube présentant le trouble le plus important, signifie que la température d'incubation de

ce tube est optimale pour la croissance.

On distingue les classes suivantes des bactéries selon leur température de croissance:
Bactéries psychrophiles: Se développent entre 0°C et 20°C avec un optimum de 15°C.
Bactéries mésophiles: Se développent entre 20 à 40°C avec un optimum de 37°C.
Bactéries thermophiles: Se développent entre 40°C et 65°C avec un optimum de 45°C.
Bactéries psychrotrophes: Se sont des mésophiles capables de se développer à basse
température.
b. Le pH:
Il s'agit de faire une culture bactérienne sur des bouillons préparés au préalable avec des pH
différent (pH acide, pH neutre, pH alcalin). Après incubation, vérifier le trouble le plus
important ce qui va indiquer le pH optimal de croissance.

On distingue les classes suivantes des bactéries selon leur pH de croissance:

Bactéries acidophiles: Se développent à pH compris entre 3 et 6.
Bactéries neutrophiles: Se développent à pH compris entre 6.5 et 7.5.
Bactéries basophiles: Se développent à pH entre 7.5 et 9.

c. Pression osmotique:
Il s'agit de faire une culture bactérienne sur des bouillons préparés au préalable avec des
concentrations graduelles de NaCl. Après incubation, vérifier le trouble le plus important ce
qui va indiquer la meilleure concentration en NaCl (pression osmotique).

On distingue les classes suivantes des bactéries selon la pression osmotique:

Les bactéries non-halophiles : NaCl est inférieure à 0,2 M.
Les espèces halophiles : NaCl supérieure à 0,2 M pour les moins halophiles à 5,2 M pour les
plus halophiles.
Les espèces halotolérantes : Ils tolèrent 7.5 à 15% de NaCl.

Remarque:
Les bactéries osmophiles: nécessitent des sucres pour leur croissance.
Les bactéries osmotolérantes: acceptent des concentrations modérées de sucres mais non
obligatoires pour leur croissance.
Les bactéries xérophiles: peuvent se multiplier en l’absence d’eau dans leur environnement.

II.2.4. Caractères du pouvoir pathogène:

Le pouvoir pathogène d'un microorganisme dépend de plusieurs paramètres, il peut être mis
en évidence par l'identification de certaines enzymes:
a. L'hémolysine:
Il s'agit d'une enzyme responsable de la lyse des Hématies, elle est mise en évidence par
culture sur gélose au sang.
Méthode:
Ensemencer la gélose au sang préalablement préparée en boite Pétri par des stries larges,
puis incuber à 37°C pendant 24 heures.
Résultat:
Au moment de la lecture, on examine la zone autour des colonies obtenues, trois cas sont
possibles:
Zone claire autour de la colonie: c'est une hémolyse complète, la bactérie est dite
Hémolysine β.
Zone verdâtre autour de la colonie: c'est une hémolyse incomplète, la bactérie est dite
Hémolysine α.
Aucune modification autour de la colonie: absence d'hémolyse, la bactérie est dite
hémolysine négative ou hémolysine ....
b. La coagulase:
Il s'agit d'une enzyme capable de coaguler le plasma sanguin, ce qui gène la phagocytose, sa
mise en evidence se fait à l aide de plasma de lapin.
Méthode:
Le principe de ce test est simple. On met en contact du plasma oxalté, incapable de coaguler
seul, avec un peu de bouillon Cœur-Cervelle où a été cultivé le germe étudié. Si
le fibrinogène, soluble dans le plasma, se transforme en fibrine solide, un caillot se formera
au fond du tube.
On peut également réaliser ce test par une agglutination sur lame. Sur une lame propre et
sèche, on met en contact une goutte de Plasma sanguin oxalté avec une goutte de bouillon
ensemencé par le germe étudié (ou 1 colonie). Si le germe possède le récepteur au
fibrinogène, il y aura une agglutination visible à l'œil nu.
Dans un tube à hémolyse stérile :

 verser 0,5 ml de bouillon cœur-cervelle ;

 verser 0,5 ml de plasma oxalaté ;
 homogénéiser et incuber à 35 - 37 °C.
Remarques : si le test est effectué avec un autre bouillon autre que le bouillon cœur-
cervelle, il est indispensable de réaliser un témoin négatif en mélangeant du bouillon et du
plasma oxalaté afin de vérifier que ce bouillon ne coagule pas lui-même le plasma stérile.
L'observation est possible à partir de 2h d'incubation.
Résultat:
Si le plasma coagule en moins de 24h, le germe possède une coagulase.
c. La phosphatase:
C'est une enzyme qui a la capacité de détruire les composés phosphorylés énergétique
(ATP), sa mise en evidence requiert l'utilisation du di-Phosphate Phénophtaléine.
Méthode:
Ensemencer un bouillon nutritif additionné de quelques gouttes de di-Phosphate
Phénolphtaléine (PDP).
Incuber à 37°C pendant 24h.
Résultat:
Au moment de la lecture, ajouter quelques gouttes de Soude (NaOH à 40%), si la couleur
rose apparait, cela signifie que le Phénolphtaléine a été libéré sous l'action d'une
phosphatase.
d. L'ADNase:
Il s'agit d'enzyme capable de détruire le matériel nucléaire des cellules, elle est mise en
évidence en utilisant une gélose contenant de l'ADN.
Méthode:
Ensemencer la gélose à ADN en boite Pétri par des points.
Incuber à 37°C pendant 24 heures.
Résultat:
Au moment de la lecture, Les boîtes sont inondées avec une solution d’acide chlorhydrique
normale ou avec une solution à 0,1 % de bleu de toluidine. Dans les 5 minutes qui suivent,
différents aspects peuvent être notés :
- Révélation à l’acide chlorhydrique :
Zone claire autour de la strie, le reste de la boîte reste opaque : la souche est DNAse (+). •
Absence de zone claire autour de la strie : la souche est DNAse (-).
- Révélation au bleu de toluidine :
Zone rose autour de la strie, le reste de la boîte reste bleu : la souche est DNAse (+).
Absence de zone rose autour de la strie : la souche est DNAse (-).