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WOLLJUNG Florian

VINCENT Quentin

WOLLJUNG Florian VINCENT Quentin Rapport de travaux pratiques de MICROBIOLOGIE DES EAUX USEES Génie Biologique –

Rapport de travaux pratiques de MICROBIOLOGIE DES EAUX USEES

Génie Biologique – Génie de l’Environnement

WOLLJUNG Florian

GB2-GE-TPB

VINCENT Quentin

Dates : 11, 14 et 16 mars 2011

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I – But de l’expérience :

VINCENT Quentin

Il s’agit d’étudier la population bactérienne d’eaux usées traitées biologiquement en les évaluant quantitativement et qualitativement. L’étude quantitative se porte sur l’évaluation de la concentration bactérienne des eaux et l’étude qualitative sur l’indentification de quelques souches. Le milieu dans lequel vivent les bactéries est la boue activée. Au niveau de la station d’épuration, elle se situe dans le bassin d’aération. Ce sont ces bactéries qui dégradent la matière organique et assainissent l’eau. Leurs contrôles dans une station d’épuration est essentiel afin de garantir une bonne épuration c’est pourquoi nous sommes amenés à étudier cette population. Nous nous cantonnerons à des analyses simples en vue d’une première approche de ces boues activées.

II Principe :

L’analyse quantitative de la concentration bactérienne se fait par dilution en cascade. Le principe est de diluer régulièrement un millilitre de boues activées et de compter le nombre de bactéries en ensemençant les dilutions. Comme une colonie provient d’une bactérie initiale, le comptage de colonies sur les boites nous permet de savoir la concentration bactérienne dans les boues activée (on dénombre plutôt des UFC (Unité Formant une Colonie) car deux bactéries proches peuvent former une grosse colonie, ce qui fausse les résultats). L’indentification de certaines souches bactériennes se fait par la détermination de leurs caractères culturaux, morphologiques et biochimiques. Leurs caractères culturaux se déterminent par l’observation à l’œil nu de différents paramètres concernant l’aspect des colonies. Les caractères morphologiques s’établissent à travers quelques observations et test rapides (coloration de Gram). Les caractéristiques biochimiques vise à déceler la présence ou non d’arsenal enzymatiques en mettant la souche bactérienne avec différents substrats (éventuellement en rajoutant des molécules permettant la visualisation coloré d’une réaction (indicateurs de pH, d’oxydoréduction …))

III Matériels et Méthodes :

1) Le dénombrement :

Il s’agit de prélever 1 mL de boues activées et de l’introduire dans 9 mL d’eau physiologique (dilution au 10 -1 ). Après homogénéisation, on préleve 1 mL de la dilution au 10 -1 que l’on introduit dans 9 mL d’eau physiologique (dilution au 10 -2 ) etc… Nous réalisons des dilutions en cascades jusqu'à 10 -7 . On ensemence ensuite

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avec 0,1 mL des dilutions 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 et 10 -7 , une boite de PCA (Plate Count Agar) pour chaque dilution, par étalement en surface.

2) L’identification:

Il s’agit dans un premier temps de purifier la souche. Comme dans les boues activées

la

population bactérienne est dense et variée, nous devons impérativement purifier

la

souche que l’on souhaite identifier. Pour cela, on réalise des isolements répétitifs

jusqu'à obtenir une souche pure. Les caractéristiques morphologiques seront établies

par l’observation du type de colonie, grâce à l’état frais et la réalisation de la coloration de Gram. Mis à part le test de la respiration enzymatique, les caractères biochimiques seront déterminés par l’ensemencement d’une micro-galerie API.

IV Résultats :

1) Observations générales :

Avant tout dénombrement ou identification, nous sommes amenés à observer à

l’état frais et par une coloration de Gram un échantillon de boue activée.

A l’état frais, nous observons beaucoup d’eucaryotes mobiles et de procaryotes

immobiles. Il y a présence de grand filament qui est surement de la matière organique sous forme de floques.

A la coloration de Gram, nous constatons à la fois des bâtonnets roses (Gram ) et

des coques violet (Gram +).

2) Le dénombrement :

Dilutions

10

-3

10

-4

10 -5

10

-6

10

-7

Nombre d’UFC

30

3

 

1 0

0

Dans l’analyse des eaux usées, il n’y a pas de normes concernant le nombre d’UFC nécessaire ni de limites à prendre en compte pour les résultats.

Nous pouvons alors déterminer le nombre d’UFC par mL de boues activées:

en compte pour les résultats. Nous pouvons alors déterminer le nombre d’UFC par mL de boues

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Avec :

∑c : somme des colonies présentes sur la boîte à prendre en compte n1 : nombre de boîtes à prendre en compte à la première dilution effectuée n2 : nombre de boîtes à prendre en compte à la deuxième dilution d1 : première dilution effectuée V : volume de l’inoculum en mL

A.N :

[UFC] = (30+3+1)

*

(1+0,1*1)*10 -3

3) L’identification :

1

0,1

= 3,1. 10 5 UFC/mL de boue.

Lorsque nous avons fait le premier ensemencement, nous avions obtenue différents type de colonies. Nous avons sélectionné deux types de souche que l’on nommera A et B. Après purification, voici leurs caractéristiques culturales et morphologiques :

Caractères culturaux

Souche

A

B

Milieux

PCA

PCA

Pureté

Pure 1

Pure 1

Taille

moyenne

petite

Forme

ronde

ronde

Surface

bombée

bombée

Bords

réguliers

réguliers

Aspect

lisse

lisse

Consistance

crémeuse

crémeuse

Odeur

Pas d’odeur particulière

Pas d’odeur particulière

Pigmentation

crème

crème

Type

S

S

 

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1 : La notion de pure indique qu’il n’y a qu’un seul type de colonie sur la gélose et que les caractéristiques à l’Etat Frais et à la coloration de Gram montrent un même type de souche.

Nous constatons que les caractères culturaux sont quasiment identiques entre les deux souches étudiées A et B. Leurs différences s’observent plus lors dans les caractères morphologiques.

Caractères morphologiques

Manipulations

Etat frais /Gram

Etat frais

Gram

Souche

Morphologie

Mobilité

Coloration

Gram

 

A bâtonnet

mobile

rose

Gram -

 

B bâtonnet

immobile

rose

Gram -

La différence entre les deux souches est leur mobilité. Afin de poursuivre l’indentification, il faut déterminer les enzymes que possèdent les souches : il s’agit des caractéristiques biochimiques.

Caractères biochimiques

Test de l’enzyme respiratoire :

Comme nous avons des bâtonnets Gram -, le test oxydase est obligatoire. Nous avons tout de même effectué un test catalase.

Enzyme testée

Souche

Observations

   

Interprétation

 

Conclusion

   

A

Coloration rose du disque

Oxydation du paraphénylène-diamine

Oxydase +

Oxydase

 

B

Coloration rose du disque

Oxydation du paraphénylène-diamine

Oxydase +

   

Apparition de

 

2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (gaz)

Catalase +

Catalase

 

A

bulles

 

Apparition de

 

2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (gaz)

Catalase +

   

B

bulles

Aucune

différence

n’est

encore

visible

puisque

les

enzymes

respiratoires

sont

identiques.

Comme il s’agit de bâtonnet Gram et Oxydase +, nous choisissons une galerie API 20E. Normalement, nous aurions du utiliser une galerie API 20 NE (Non Enterobactérie) car les Enterobacteries ne possède pas l’oxydase. Mais une galerie API 20E ou 20NE ont principalement les mêmes caractéristiques.

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Microgalerie API 20E :

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WOLLJUNG Florian Microgalerie API 20E : VINCENT Quentin Fiche API de la souche A Fiche Api

Fiche API de la souche A

API 20E : VINCENT Quentin Fiche API de la souche A Fiche Api de la souche

Fiche Api de la souche B

Les deux souches identifiées sont :

Souche A = Aeromonas hydrophila (76,5%) Souche B = Pasteurela multocida (99,4%)

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V Interprétations :

1) Le dénombrement :

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La normalisation concernant la concentration en population bactérienne n’est pas établie. En fait, ce paramètre est pris en compte dans la législation à travers les caractéristiques physico-chimique des boues, c’est à dire la Matière Organique (la MVS=Matière Volatile Solide est le caractère le plus représentatif de la biomasse épuratoire). Concernant la concentration obtenue, on a pu constater que les dilutions effectuées étaient trop élevée. En effet, les eaux usées de la station de Drunsenheim sont faiblement chargées en matière organique (résultats en adéquation avec ceux obtenue en TP eaux usées) et de telle dilution n’était pas nécessaire.

2) L’identification:

Aeromonas hydrophila est une souche très répandue dans les boues de stations d’épuration. Aeromonas hydrophila a une répartition géographique mondiale dans les eaux douces, les eaux de faible salinité, la vase, les sédiments et, d’une manière générale, l’environnement aquatique constituent l’habitat principal de ce germe. Avec Pseudomonas sp. il s’agit d’un germe lipolytique : il dégrade les graisses présent dans les eaux usées. Leurs présence est donc habituelle et indispensable (P.CHAPPE La microflore des boues aérobies acclimatées à des teneurs élevées en graisses).

Cependant, l’indentification de Pasteurela multocida est beaucoup plus douteuse. Ce germe n’est pas une bactérie habituellement rencontrée dans les boues de station d’épuration. En effet, les Pasteurella sont des hôtes obligatoires des animaux, des vertébrés surtout, chez qui ils se comportent comme des commensaux de la cavité buccale et qu'on isole de la salive. Elles peuvent survivre quelque temps dans le milieu extérieur mais ne s'y développent pas. De ce fait, leurs présences dans les boues activées aérobie est surprenante. Nous supposons donc que l’identification est incertaine. Il faudrait donc refaire une galerie API20E pour vérifier ce résultat.

V Conclusions :

La concentration bactérienne dans les boues activées est d’environ 3.10 5 UFC/mL de boue. Parmis la variété de souche présente dans les boues, nous avons indentifié Aeromonas hydrophila et Pasteurela multocida (l’identification certaine du 2 ème germe reste sous réserve).

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