WOLLJUNG Florian

VINCENT Quentin

Rapport de travaux pratiques de MICROBIOLOGIE DES EAUX USEES

Gnie Biologique Gnie de lEnvironnement WOLLJUNG Florian VINCENT Quentin
GB2-GE-TPB

Dates : 11, 14 et 16 mars 2011

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I But de lexprience :
Il sagit dtudier la population bactrienne deaux uses traites biologiquement en les valuant quantitativement et qualitativement. Ltude quantitative se porte sur lvaluation de la concentration bactrienne des eaux et ltude qualitative sur lindentification de quelques souches. Le milieu dans lequel vivent les bactries est la boue active. Au niveau de la station dpuration, elle se situe dans le bassin daration. Ce sont ces bactries qui dgradent la matire organique et assainissent leau. Leurs contrles dans une station dpuration est essentiel afin de garantir une bonne puration cest pourquoi nous sommes amens tudier cette population. Nous nous cantonnerons des analyses simples en vue dune premire approche de ces boues actives.

II Principe :
Lanalyse quantitative de la concentration bactrienne se fait par dilution en cascade. Le principe est de diluer rgulirement un millilitre de boues actives et de compter le nombre de bactries en ensemenant les dilutions. Comme une colonie provient dune bactrie initiale, le comptage de colonies sur les boites nous permet de savoir la concentration bactrienne dans les boues active (on dnombre plutt des UFC (Unit Formant une Colonie) car deux bactries proches peuvent former une grosse colonie, ce qui fausse les rsultats). Lindentification de certaines souches bactriennes se fait par la dtermination de leurs caractres culturaux, morphologiques et biochimiques. Leurs caractres culturaux se dterminent par lobservation lil nu de diffrents paramtres concernant laspect des colonies. Les caractres morphologiques stablissent travers quelques observations et test rapides (coloration de Gram). Les caractristiques biochimiques vise dceler la prsence ou non darsenal enzymatiques en mettant la souche bactrienne avec diffrents substrats (ventuellement en rajoutant des molcules permettant la visualisation color dune raction (indicateurs de pH, doxydorduction ))

III Matriels et Mthodes :

1) Le dnombrement :
Il sagit de prlever 1 mL de boues actives et de lintroduire dans 9 mL deau physiologique (dilution au 10-1). Aprs homognisation, on prleve 1 mL de la dilution au 10-1 que lon introduit dans 9 mL deau physiologique (dilution au 10-2) etc Nous ralisons des dilutions en cascades jusqu' 10 -7. On ensemence ensuite
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avec 0,1 mL des dilutions 10-3 10-4 10-5 10-6 et 10-7, une boite de PCA (Plate Count Agar) pour chaque dilution, par talement en surface.

2) Lidentification:
Il sagit dans un premier temps de purifier la souche. Comme dans les boues actives la population bactrienne est dense et varie, nous devons imprativement purifier la souche que lon souhaite identifier. Pour cela, on ralise des isolements rptitifs jusqu' obtenir une souche pure. Les caractristiques morphologiques seront tablies par lobservation du type de colonie, grce ltat frais et la ralisation de la coloration de Gram. Mis part le test de la respiration enzymatique, les caractres biochimiques seront dtermins par lensemencement dune micro-galerie API.

IV Rsultats :
1) Observations gnrales :
Avant tout dnombrement ou identification, nous sommes amens observer ltat frais et par une coloration de Gram un chantillon de boue active. A ltat frais, nous observons beaucoup deucaryotes mobi les et de procaryotes immobiles. Il y a prsence de grand filament qui est surement de la matire organique sous forme de floques. A la coloration de Gram, nous constatons la fois des btonnets roses (Gram ) et des coques violet (Gram +).

2) Le dnombrement :
Dilutions Nombre dUFC 10-3 30 10-4 3 10-5 1 10-6 0 10-7 0

Dans lanalyse des eaux uses, il ny a pas de normes concernant le nombre dUFC ncessaire ni de limites prendre en compte pour les rsultats. Nous pouvons alors dterminer le nombre dUFC par mL de boues actives:

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Avec : c : somme des colonies prsentes sur la bote prendre en compte n1 : nombre de botes prendre en compte la premire dilution effectue n2 : nombre de botes prendre en compte la deuxime dilution d1 : premire dilution effectue V : volume de linoculum en mL A.N : [UFC] = (30+3+1) * -3 (1+0,1*1)*10 1 = 3,1. 105 UFC/mL de boue. 0,1

3) Lidentification :
Lorsque nous avons fait le premier ensemencement, nous avions obtenue diffrents type de colonies. Nous avons slectionn deux types de souche que lon nommera A et B. Aprs purification, voici leurs caractristiques culturales et morphologiques :

Caractres culturaux
Souche Milieux Puret Taille Forme Surface Bords Aspect Consistance

A
PCA Pure1 moyenne ronde bombe rguliers lisse crmeuse

B
PCA Pure1 petite ronde bombe rguliers lisse crmeuse Pas dodeur particulire crme S

Odeur Pas dodeur particulire Pigmentation

crme S

Type

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1 : La notion de pure indique quil ny a quun seul type de colonie sur la glose et

que les caractristiques lEtat Frais et la coloration de Gram montre nt un mme type de souche. Nous constatons que les caractres culturaux sont quasiment identiques entre les deux souches tudies A et B. Leurs diffrences sobservent plus lors dans les caractres morphologiques. Caractres morphologiques Manipulations Souche A B Etat frais /Gram Morphologie btonnet btonnet Etat frais Mobilit mobile immobile Gram Coloration rose rose Gram Gram Gram -

La diffrence entre les deux souches est leur mobilit. Afin de poursuivre lindentification, il faut dterminer les enzymes que possdent les souches : il sagit des caractristiques biochimiques. Caractres biochimiques Test de lenzyme respiratoire : Comme nous avons des btonnets Gram -, le test oxydase est obligatoire. Nous avons tout de mme effectu un test catalase. Observations Interprtation Conclusion Coloration rose du Oxydation du A Oxydase + disque paraphnylne-diamine Oxydase Coloration rose du Oxydation du B Oxydase + disque paraphnylne-diamine Apparition de A 2H2O2 2H2O + O2(gaz) Catalase + bulles Catalase Apparition de B 2H2O2 2H2O + O2(gaz) Catalase + bulles Aucune diffrence nest encore visible puisque les enzymes respiratoires sont identiques. Comme il sagit de btonnet Gram et Oxydase +, nous choisissons une galerie API 20E. Normalement, nous aurions du utiliser une galerie API 20 NE (Non Enterobactrie) car les Enterobacteries ne possde pas loxydase. Mais une galerie API 20E ou 20NE ont principalement les mmes caractristiques.
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Enzyme teste

Souche

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Microgalerie API 20E :

Fiche API de la souche A

Fiche Api de la souche B

Les deux souches identifies sont : Souche A = Aeromonas hydrophila (76,5%) Souche B = Pasteurela multocida (99,4%)
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V Interprtations :
1) Le dnombrement :
La normalisation concernant la concentration en population bactrienne nest pas tablie. En fait, ce paramtre est pris en compte dans la lgislation travers les caractristiques physico-chimique des boues, cest dire la Matire Organique (la MVS=Matire Volatile Solide est le caractre le plus reprsentatif de la biomasse puratoire). Concernant la concentration obtenue, on a pu constater que les dilutions effectues taient trop leve. En effet, les eaux uses de la station de Drunsenheim sont faiblement charges en matire organique (rsultats en adquation avec ceux obtenue en TP eaux uses) et de telle dilution ntait pas ncessaire.

2) Lidentification:
Aeromonas hydrophila est une souche trs rpandue dans les boues de stations dpuration. Aeromonas hydrophila a une rpartition gographique mondiale dans les eaux douces, les eaux de faible salinit, la vase, les sdiments et, dune manire gnrale, lenvironnement aquatique constituent lhabitat principal de ce germe. Avec Pseudomonas sp. il sagit dun germe lipolytique : il dgrade les graisses prsent dans les eaux uses. Leurs prsence est donc habituelle et indispensable (P.CHAPPE La microflore des boues arobies acclimates des teneurs leves en graisses). Cependant, lindentification de Pasteurela multocida est beaucoup plus douteuse. Ce germe nest pas une bactrie habituellement rencontre dans les boues de station dpuration. En effet, les Pasteurella sont des htes obligatoires des animaux, des vertbrs surtout, chez qui ils se comportent comme des commensaux de la cavit buccale et qu'on isole de la salive. Elles peuvent survivre quelque temps dans le milieu extrieur mais ne s'y dveloppent pas. De ce fait, leurs prsences dans les boues actives arobie est surprenante. Nous supposons donc que lidentification est incertaine. Il faudrait donc refaire une galerie API20E pour vrifier ce rsultat.

V Conclusions :
La concentration bactrienne dans les boues actives est denviron 3.10 5 UFC/mL de boue. Parmis la varit de souche prsente dans les boues, nous avons indentifi Aeromonas hydrophila et Pasteurela multocida (lidentification certaine du 2me germe reste sous rserve).
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