PROJET DE FIN D’ANNÉE

(2022 /2023 )
SPÉCIALITÉ :
BIOTECHNOLOGIE
MICROBIENNE

Titre du mémoire :
Etude in vitro du potentiel probiotique de nouvelles
Souches destinées à l’aquaculture
I. Introduction :
Historique de probiotique :
Le terme “probiotique” fut introduit pour la première fois en 1965 par
Lilly et
Stillwell ; par opposition aux antibiotiques les probiotiques furent
définis comme des
facteurs dérivés des microorganismes et stimulant la croissance des
autres organismes
En 1989, Roy Fuller a mis l’accent sur la nécessité de viabilité des
probiotiques et a introduit l’idée qu’ils avaient un effet bénéfique sur
l’hôte.
Les probiotiques sont partout, dans les publicités, les pharmacies et
les supermarchés, et prétendent nous aider à tout soigner. Non seulement
chaque probiotique est unique mais tous les produits qui s’en réclament
ne se valent pas
On trouve les probiotique dans l’alimentation : les
produits laitiers, le yaourt , les boissons fermentées , les
dérivés du soja , légumes fermentés , la choucroute , le
Kimichi , levure de bière , le vinaigre de cidre .
De ce fait et depuis le 1er Janvier 2006, l’Union Européen
a décidé d’interdire l’utilisation des
antibiotiques comme additifs en alimentation animale.
Pour cette raison, plusieurs travaux ont
été focalisé dans le but de trouver d’autres substances
bio-thérapeutiques alternatives ayant des
N,n
effets bénéfiques telles que les probiotiques (Alonso et al.,
2019; FAO/WHO/OIE, 2006;
Kaktcham et al., 2018; Kavitha et al., 2018; Samson et
al., 2020).
Comment fonctionnent –ils ? En quoi nous sont-ils
vraiment utiles ? Comment les choisir ? Explications.
La position géographique de la Tunisie qui est largement
ouverte sur la mer, avec des côtes dépassant 1300 km,
contribuent à l'évolution de l'aquaculture dans notre
pays. Selon le rapport « Vue générale du secteur
aquacole national Tunisie » publié par la FAO
(organisation des nations unies pour l’alimentation et
agriculture), l’aquaculture tunisienne évolue avec un
taux de croissance de 20% /an jusqu'à 2014 et la
production actuelle est à peu près 21 756 tonnes en
2018
L'utilisation des probiotiques en aquaculture augmente
avec les demandes d'éco-responsabilité du secteur. De
nombreuses préparations commerciales de
probiotiques sont disponibles commercialement pour
être introduites comme additifs dans l'alimentation
des poissons, crustacés et mollusques d'élevage.
DÉFINITION DE PROBIOTIQUE :

Biologie Qui contient des micro-

organismes vivants (bactéries,
levures…) exerçant un effet
bénéfique sur l'organisme qui les
ingère. Le yaourt est un aliment
probiotique.
 Les bactéries probiotiques sont
répertoriées en 4 genres
différents ( Lactobacilles ,
bifidobactéries streptocoques ,
Lactocoques )qui donnent des
milliers d’aspéces et des
centaines de milliers de souches
différentes .
Les étapes de fabrication de probiotique :

i. Conservation des souches

ii. Préparation de l’incoculum
iii. Pré-fermentation
iv. L’ultra-filtration
v. Lyophilisation
vi. Broyage
vii.Conditinnement
Différence entre un probiotique et un prébiotiques :

Probiotique Prébiotique
Microorganismes Ingrédients alimentaire
vivants qui lorsqu’ils résistants à la digestion
sont administrés en qui induisent des
quantité adéquate ont changements
des effets bénéfique sur spécifiques dans la
la santé de l’hôte composition et/ou
l’activité du microbiote
intestinal produisant
ainsi un effet bénéfique
sur la sante de l’hôte
Matériels &
méthodes
 I. MATÉRIELS
1. Souches bactériennes:
1.1 collection des souches
Cinquante-neuf souches ont été isolées du laboratoire à partir de différents
biotopes : intestins , mucus intestinal et de la peau ainsi de l’eau de
mer.
1.2 Souches indicatrices
Dix Huit souches bactériennes indicatrices ont été utilisées pour étudier
l’antagonisme au cours de ce travail telque: Esherichia coli ; Pseudomonas
aeruginosa ; Salmonella typhimurium ; Staphylococcus aureus ; etc…
2. Milieux:
Les milieux des cultures utilisés sont soit des milieux liquides, soit des
milieux solides additionnés d’agar-agar, qui sont tous stériles.
• Milieux utilisés pour l’isolement et la culture des bactéries: Milieu TSB
• Milieux de détection des activités enzymatiques: Milieu d’amidon, Milieu de
l’huile d’olive et Rhodamine et un milieu GNL(Gélose Nutritive au Lait).
• Milieux pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques: Milieu Mueller
Hinton .
3. Tampons: on utilise des différents Tampons: Tampon PBS, Tampon
4. Solutions: solution de Crystal Violet.
5. Réactifs: marqueur de taille d’ADN.
6. Produits chimiques: Les produits chimiques utilisés sont fournis par Sigma, Pro-
labo , Bio-Rad et Pharmacia.
7. Les enzymes: Protéinase K.
8. Oligonucléotides: Pour les amplifications d’ADN par PCR, on utilise les deux
oligonucléotides suivantes : ED1 et RD1.

II. METHODES
1) Isolement des souches de bactéries à partir de différent
biotopes:
Hémogénisation des échantillons, puis, la purification par la méthode de l’étalement
sur boite de Pétries. Après incubation, on fait l’observation microscopique des
colonies. Enfin, on effectué la coloration de Gram et des tests de l’activité de
catalase.
2) Méthodes d’évaluation des propriétés probiotiques des souches:
a. Détermination de l’activité enzymatique
On utilise la technique de diffusion dans l’agar pour déterminer les activités
enzymatiques. D’où, la présence des halos transparantes autour des colonies
traduit la présence d’activité Protéolytique, Amylase et Activité lipase.
b. Détermination de l’activité antibactérienne
On adoptant la technique de Barbosa et al et Seghounni et al avec quelques
modifications. L’activité antimicrobienne a été évaluée on observant la
Présence de zones d’inhibition autour des colonies.
c. Détermination de l’activité antibactérienne extracellulaire et sa nature
L’activité antimicrobienne extracellulaire de surnageant a été déterminée par
un test de diffusion sur puits d’agar (ADT). D’où l’activité antimicrobienne a
été définie par la présence d’une zone inhibitrice claire autour des puits.
Ensuite, on déterminant leur nature par un traitement de neutralisation de
pH, traitement thermique, traitement par des enzymes protéolytiques et un
échantillon témoin.
d. Préparation des cellules végétatives et des spores
Pour préparer les spores, on élimine les cellules végétatives. Puis, les spores
ont été purifiées on utilisant une solution de Lysozyme. Après lavage,
chauffage et centrifugation, la suspension des pores a été stockée.
e. Test de servie dans les conditions gastro-intestinales
Pour étudier la tolérance des souches bactériennes à l’acidité de l’estomac et
la basicité de l’intestin. La tolérance des cellules végétatives et des spores
des souches isolées au pH bas et aux sels binaires a été évaluée comme
décrit par Barbosa et al (2005) avec quelques modifications.
f. Test d’autoagrégation et de coagrégation
Après incubation des souches isolées et les souches indicatrices,
l’absorbance(A) a été mesurée à 600 nm. Le pourcentage d’autoagrégation a
été exprimée comme suit:
%Agg = 1 – ( At / Ao) × 100
D’où At:absorbanse à t=1,2,3,4 h et Ao:absorbance à t=0
1. L’essai de co-agrégation se fait de même manière que l’analyse d’auto-
agrégation. La co-agrégation est calculée comme suit:
% Co-agg =[ (Apat + Aisoplate) -2 (Amix) / (Apat + Aisolate)] × 100
D’où Aprob et Aindicat : DO600 de chaque suspension bactérienne
et Amix : le mélange.

g. Test d’adhésion
La méthode au cristal violet a été utilisée pour déterminer la capacité
d’adhésion. Ce test a été effectué sur des mucus intestinaux et de la peau de
deux espèces des poissons .
h. Résistance aux antibiotiques
Elle a été déterminée par la méthode de diffusion des disques imprégnés
d’antibiotiques et la mesure des diamètres d’inhibition. Les résultats sont
exprimés en Sensible (S) et Résistante (R).
3) Identification des souches:
a. Phénotypiquement
 Sporulation: est la transformation de la forme végétative en spore. La
sporulation intervient lorsque les conditions deviennent défavorables à la
croissance.
 Coloration de Gram: Pour mettre en évidence les bactéries Gram- et
bactérie Gram+. Suite à une double coloration, les bactéries Gram+
apparaissent en violet foncé alors que les bactéries Gram- sont colorés en
rose ou en rouge.
 Test catalase: Suite à l’utilisation de test catalase la présence de l’enzyme se
manifeste par un dégagement des bulles de gaz.
 Galerie Api: Permet d’indentification de microorganismes par la réalisation rapide
et facile de plusieurs types de tests biochimiques miniaturisés.
b. Génotypiquement
 Extraction d’ADN génomique: On réalise l’extraction d(‘ADN à partir des
cellules bactériennes cultivées sur milieu TSB.
 Quantification et qualification de l’ADN: La détermination de la quantité et
qualité d’ADN a été réalisé par élèctrophorèse après migration des échantillons
sur gel d’agarose.
 Amplification de gène codant pour l’ARNr 16S par PCR : La technique
d’amplification en chaine par polymérase qui permet d’amplifier spécifiquement
une séquence d’ADN à l’aide de 2 oligonuclèotides s’hybrident avec des
séquences complémentaires bordant la séquence à amplifier. Cette technique
comprend le trois étapes suivants:
- Dénaturation de la matrice
- Hybridation des oligonucléotides à la matrice.
- Elongation de la chaine d’ADN.
 Séquençage de l’ADN et alignement des séquences avec les banques de
données:
Le séquençage de l’ADN nécessaire pour déterminer l’ordre d’enchainement des
nucléotides et des bases pour un fragment d’ADN donné on utilisant le
séquenceur automatique ABI Prism 3100.
Résultats &
conclusions
RÉSULTAT ET DISCUSSION:
La sélection préliminaire des bactéries probiotiques s’est basé sur une méthode de criblage
soustractive qui implique une série de test in vitro.il s’ agit de la vérification de
l’innocuité des souches par leur identification. 1) Caractérisation des
souches :
De nombreuses souches bactériennes,à gram+ et gram- sont connues pour leurs
potentialités probiotiques .
Nous avons isolés et purifiés 59 souches de différents biotopes marins:
 Intestin et mucus de soie: 29
 Intestin de daurade: 9
 Mucus de mulet lippu: 13
 Eau de mer : 8
Nous avons choisi dans cette étude d’étudier leur pouvoir probiotique in vitro .
2) Sélection de souches ayant des propriétés probiotiques:
a) Critères technologique:
 Production d’enzymes extracellulaires :
Nous pouvons déduire du tableau 5 que la majorité des souches étudiées présentent une
croissance avec production d’activités amylolytique,lipidique et protéolytique traduite
par l’apparition d’un halo clair.
De plus , il apparait que l’ensemble des bactéries isolées présentent une activité lipolytique
et protéolytique à l’exeptionD8.
 b) Critères fonctionnels:
 Détermination de l’activité
antibactérienne:
se basant sur leur potentiel de
produire des activités
antibactérienne contre les
bactéries pathogènes à gram- et à
gram+ , nous avons retenu 28
souches de différents biotopes
présentant des activités
antibactériennes important
marquées par des halos
d’inhibition contre staphylococcus
aureus et vibrio harveyiLg26/01.
cette activité été faible contre
A.hydrophile et V.protéolytique.

Tableau 1:activité amylolytique ,lipolytique et

Figure1:Activité des souches contre staphylococcus
protéolytique des souches isolées.
areus et vibrio harveyilg26/01.
 détermination de l’activité antibactérienne par surnageant:
Les résultats obtenus d’après les 3 traitement appliqué aux surnageant
montrent que les activités biologiques produites sont affectées suite au
traitement par la protéinase K . En revanche, aucun effet n’a été observé
après la neutralisation des surnageant. De même, la traitement thermique
a un effet sur la majorité des souches.ces résultats attestent que
l’inhibition de la croissance des souches indicatrices est peut être de
nature peptidique .
 Capacité de croissance dans les conditions gastro-intestinales(Ph et
sels biliaires):
l’étude de la croissance des différentes souches sélectionnées à différents ph
acides variable et des concentrations différentes de sels biliaires.cette etude
révèle que les souches sont capables de tolérer les ph acides.elles montrent
également un bonne croissance en présence de bile même à une
concentration de 2,5%. La majorité des spores sont capables de résisté au
Ph le plus acide et une forte concentration de sel biliaire.
 Tests d’autoagrégation et de coagrégation:

Les résultas obtenus dans le tableau 6 un agrégation acceptable qui varie

entre 14,25 %et 86,4%,ou les suspensions présentaient à la fois un
précipité et une turbidité constante. La capacité d’agrégation est liée à
l’adhésion cellulaire .
  Test d’adhésion:
La capacité d’adhésion des
bactéries à potentialité probiotique
aux muqueuses intestinales ,à été
largement décrite dans la
littérature .elle dépend
essentiellement de la nature et
composition de la paroi cellulaire.

Figure2 : adhésion des souches sélesctionnées (a) et

leur spores (b) aux mucus intestinaux et de la
Tableau 2: Pourcentages d’autoagrégation et de
peau de deux éspèces de poisson,mulet et
coagrégation des souches sélectionnées
sole.
Les résultats ont révélé des différences d'adhésion aux deux espèces de
poisson (Figure2 ). En effet, les souches sélectionnées (figure 2a) ont
mieux adhéré à l’IM de Sole et à SM Mule avec des pourcentages
d’adhésion variant entre 5-70%. Toutefois, la capacité d’adhésion des
spores est plus importante que celui des souches dépassant 70% IM du
mulet et 80% SM mulet respectivement.

L’adhésion des souches probiotiques aux entérocytes empêche leur

expulsion rapide par la contraction et les mouvements de péristaltisme
intestinal et pourrait également empêcher la fixation d'agents pathogènes
par des interactions stériques ou spécifiques et ceci par le blocage des
récepteurs cellulaires de tractus intestinal
 Résistance aux antibiotique:

Une souche probiotique ne doit présenter aucune forme aux

antibiotiques.une bactérie est considéré comme sensible lorsque le
diamètre du contour sur gélose dépasse le diamètre limite . Les résultats
obtenus montrent que ces quatre souches (SM6, EM2, EM7, M4)
présentent une sensibilité envers la majorité des antibiotiques.
3) Identification des souches :
a) Identification biochimique par galerie Api 50CH Rèf 50300:
La lecture de résultat d’une galerie Api se fait comme suit : on fait deux
relevés de résultats; à 24h et 48h.
Suite à la lecture des résultats et en se référant aux tableaux d’identification
associés à cette galerie, les souches SM6, EM2, EM7 et M4 ont été
identifiée comme étant respectivement Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
cereus, Bacillus badiuset Bacillus licheniformis.
b) Identification génétique :

Après 30 cycles d’amplification, le produit de la PCR est analysé sur gel

d’agarose 0,8% (figure 9). Le fragment amplifié a une taille d’environ 1500
pb.Le séquençage des produits PCR pour les souches sélectionnées est en
cours.

Figure3 : profil sur le gel d’agarose 0.8%des produits de PCRobtenus à

partir des souches.
CONCLUSION :
 Nous avons sélectionné, à partir d’une collection de 59 bactéries isolées au
sein du laboratoire LBMEB, des souches ayant les meilleures propriétés
probiotiques moyennant une procédure de criblage soustractif comprenant
plusieurs tests in vitro.

• D'après les résultats obtenus, nous pouvons conclure que parmi les
souches isolées étudiées les seules quatre souches ont répondu
positivement aux critères de sélection se sont SM6, EM2, EM7 et M4 qui
peuvent être considérées comme potentiellement probiotique ; du fait de
leur résistance au stress acide et aux sels biliaires, leur sensibilité à la
plupart des antibiotiques testés, leur large spectre d'action contre les
bactéries pathogènes et aussi leur capacité d'adhésion.

 Ces souches présentent aussi une propriété intéressante qui consiste à

leur aptitude à produire des enzymes bénéfiques .

 Nous avons aussi réalisé des études moléculaires par amplification et

séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S afin de les identifié . Les
résultats d’analyse des produits PCR sont en cours de séquençage.
Merci pour votre
attention.