Biologie 1ère Laboratoire STP

CULTURE DE BACTERIES
La microbiologie est l'étude de très petits organismes, micro-organismes, qui ne
peuvent pas être observés à l’œil nu. Afin de les observer et d’étudier leurs
caractéristiques morphologiques, il est donc nécessaire d’examiner des amas de
cellules appelées colonies (visualisation macroscopique, à l’œil nu) ou de visualiser
des cellules individuelles à l'aide d'un microscope (visualisation microscopique). Il y a
plusieurs groupes d'organismes qui entrent dans cette catégorie, y compris les
bactéries, les algues, les champignons et les protistes. Dans ce groupe, il y a plusieurs
espèces intéressantes pour les humains en raison de leur capacité à causer des
maladies ou leur utilisation dans l'industrie alimentaire. L'accent au cours de ce travail
pratique sera mis sur les bactéries en réalisant des cultures.

MILIEUX DE CULTURES

Milieux liquides
Sérum de bœuf, sérum de cheval, bouillon de viande protéiné et salé.

Milieux gélosés
La gélose se différencie du bouillon par sa solidité due, dans sa composition, à la
présence d'agar-agar à hauteur de 20 g/L environ. L'agar-agar est un produit gélifiant
obtenu à partir d'algues rouges.

Exemple : Milieu LB (Luria Bertani) composé de levures, de protéines et de NaCl.

Milieux solides
Des pommes de terre, des carottes, des morceaux de pommes.

Milieu ECGF : notez la composition du milieu qui a été préalablement préparé.

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RÉALISER UN ENSEMENCEMENT

L’ensemencement est le fait d’introduire des microorganismes ou leurs spores

dans un milieu de culture pour les faire proliférer.

EXAMEN MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES

VISUALISATION MACROSCOPIQUE – MORPHOLOGIES COLONIALES

L’identification préliminaire des microorganismes peut être fondée sur la morphologie
coloniale. Chaque colonie simple représente une population de cellules bactériennes
originaire d'une seule et unique cellule qui, après de multiples cycles de division
cellulaire, a généré une colonie.

Les cellules s’empilent les unes sur les autres selon une forme caractéristique au type
bactérien (tout comme un amas de bananes a une apparence différente d’un amas de
pommes de terre). La morphologie d'une colonie bactérienne est une fonction de
plusieurs facteurs intrinsèques à la bactérie telle que la forme de la cellule (contour,
relief, surface…), sa taille, sa mobilité et sa physiologie (production d’une capsule
ou non). Mais des facteurs extrinsèques peuvent également entrer en matière : par
exemple la présence de colorant dans le milieu de culture. Il est aussi important de
noter que les colonies d'un type bactérien donné ont souvent des couleurs, des
textures et des odeurs distinctes.

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Référez-vous aux figures ci-dessous pour distinguer les morphologies des colonies
que vous observerez.

Résultats macroscopiques de cultures en boîtes de Pétri

(www.ccdmd.qc.ca/ri/gestesdelascience)

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VISUALISATION MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES AVEC COLORATIONS

SIMPLES
Les cellules microbiennes sont incolores et donc très difficiles à visualiser même avec
un microscope. Par conséquent, diverses procédures de coloration permettent de
visualiser et de classifier les microbes. Pour effectuer des colorations simples, on
utilise seul colorant tel que le bleu de méthylène. Dans ce cas, toutes les cellules
sont colorées de la même couleur. Les colorations simples sont utiles pour examiner
les différentes tailles, formes et agrégations de cellules bactériennes.

PH ET BACTÉRIES

Le pH est un indice exprimant la concentration des ions hydrogène dans une solution
et par lequel on déduit le degré d’acidité. Une solution neutre a un pH égal à 7. Une
solution acide a un pH inférieur à 7, et une solution basique/alcaline a un pH supérieur
à 7. Les milieux trop basiques/alcalins (pH élevé, par exemple 13 ou 14) ou trop acide
(pH bas, par exemple 1 ou 2) nuisent au développement de la plupart des bactéries.

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Ci-dessous, une liste de pH de substances courantes

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TRAVAIL PRATIQUE : 1 È R E PARTIE

Les bactéries vivent partout autour de nous et même à l'intérieur de notre corps. Avec
cette expérience vous allez essayer de mettre en évidence la diversité des lieux dans
lesquels on les rencontre. Pour cela vous aller prélever des échantillons que vous
mettrez en culture.

Matériel à disposition

• Boîte de pétri avec milieu de culture ECGF

• Instruments de prélèvement (Q-Tips, fil dentaire, cure-dents, brucelles, …)
• Parafilm
• 1 feutre permanent
• Etuve
• Réfrigérateur
• Microscope

Méthodes et précaution

• Avec le feutre permanent, noter sur le couvercle de la boîte de Pétri le nom de la

classe et votre nom. Tracer deux axes qui délimitent quatre parties égales
(cadrans) sur le fond de la boîte et les numéroter.
• Choisir 4 objets dans votre environnement proche, susceptibles de contenir des
bactéries. Lister-les et attribuez un numéro de cadran à chacun.
Il est très important de travailler avec beaucoup de rigueur et de propreté pour éviter
de contaminer les milieux de cultures avec d'autres bactéries.

• Déposer un échantillon par cadran à l’aide de l’instrument adéquat. Attention le gel

est fragile, n’appuyez pas trop fort.
• Manipuler les boîtes de pétri avec précaution : ne les ouvrir qu'au moment d'y
déposer les échantillons choisis, et ensuite les refermer rapidement.
• Eviter de parler en direction des boîtes lorsqu'elles sont ouvertes.
• Une fois ensemencées, refermer les boîtes avec une bande de parafilm.
• Les boîtes sont déposées dans l'étuve à 37°C pour incubation pendant 12 à 24
heures, puis placées dans le réfrigérateur jusqu’à l’observation.

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• Rédiger avec vos propres mots (pas de copié-collé) et en l’adaptant à votre cas
concret (ex. matériel) les points 1 et 2 du rapport d’expérience déposé sur Moodle
(LABO 3).
• Si vous faites cette première partie en version informatique elle doit être
imprimée et amenée sur papier pour la suite du laboratoire.

TRAVAIL PRATIQUE : 2 È ME PARTIE

Récupérez votre boîte de Petri, observez et continuez à rédiger votre rapport en vous
aidant du plan suivant.

3.1. Résultats macroscopiques

• Sortir les cultures, examiner macroscopiquement (à l’œil nu) les différentes zones
contaminées en vous référant aux schémas de la page 3. Décrivez chaque cadran
le plus précisément possible : nombre de colonies, formes, couleur etc

• Faites une photo de la boîte avec les cultures et déposez-là dans le dossier devoir
prévu sur LABO 3 du Moodle.

3.2. Résultats microscopiques -> travaillez proprement et avec précision !

• Choisissez une colonie, faites un prélèvement (cure-dent, cf. cellule épithélium
buccal) que vous observerez au microscope : grossissement 400X et coloration
bleu de méthylène (attention le bleu de méthylène est salissant et toxique).
• Faites une photo du champ de vision (400X) et déposez-là dans le dossier devoir
prévu sur LABO 3 du Moodle.
• Dessinez en suivant les règles du dessin d’observation à l’ECGF.

4.1. Evaluation des résultats macroscopiques

• Formulez des hypothèses (une hypothèse par cadran -> 4 hypothèses différentes)
qui explique la présence plus ou moins importante de colonies.

4.2. Evaluation des résultats microscopiques

• Nommez les bactéries que vous reconnaissez à l’aide du tableau de la page 4.

N’oubliez pas la conclusion !