Biochimie & Physiologie microbiennes

TP N°1
ISOLEMENT ET PURIFICATION D’ENTEROBACTERIES A PARTIR D’UN
ECHANTILLON DE SOL

INTRODUCTION
Les sols constituent un réservoir important de biodiversité microbienne. La microflore du sol
est formée de bactéries et d’archaebactéries, de champignons (levures et moisissures),
d’algues et de protozoaires. Pour la plupart, les microorganismes adhèrent, de manière
spécifique ou non spécifique, aussi bien aux particules inertes qu’aux surfaces des organismes
vivant du sol. Parmi les microorganismes observables au microscope, à partir d’un échantillon
de sol, on estime environ que moins de 10% ont pu être cultivés et identifiés.

BUT
Au cours de ce TP, l'étudiant sera capable de :

 Isoler les microorganismes à partir d'un échantillon de sol forestier.

 Estimer le nombre de la flore microbienne non exigeante et des entérobactéries.
 Identifier macroscopiquement les différentes colonies observées sur les milieux de culture
GN et EMB.
 Purifier les colonies identifiées des entérobactéries sur le milieu EMB.

PRINCIPE
L’isolement consiste à réaliser à partir d’un échantillon des suspensions-dilutions. Ces
dernières sont ensemencées sur milieu de culture solide. Au terme de l’incubation, les germes
contenus dans le sol seront développés. Chaque germe sera à l’origine d’une colonie, le
comptage des colonies permet par méthode de calcul simple d’estimer la quantité de germes
contenue dans le sol étudié.
L’utilisation d’un milieu sélectif comme le milieu EMB permettra le criblage des bactéries à
Gram négatif (entérobactéries) présentes dans l’échantillon de sol, leur isolement, et leur
purification.

MODE OPERATOIRE

I. Isolement primaire
1. Prélèvement
Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever le plus stérilement
possible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants. On veillera à
prélever une masse supérieure à 10g. Puisque par la suite nous aurons besoin de deux fois 5g
de terre, une pour déterminer le poids sec, l’autre pour déterminer la flore présente.

2. Extraction
A partir de cet échantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre.

 Le contenu de la première pesée sera placé directement au four pasteur pendant 6h à

180°C afin de déterminer le poids sec de l’échantillon.
 Le contenu de la deuxième pesée est placé dans un mortier en présence de 30 mL de
solution d’extraction (eau physiologique). On broie alors à l’aide d’un pilon la terre,

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puis on transvase le tout dans une éprouvette graduée de 50 mL. Le pilon et le mortier
sont rincés avec la solution d’extraction afin de récupérer toute la terre présente.
 Compléter l’éprouvette à 50 mL avec la solution d’extraction.
 L’échantillon est homogénéisé au vortex puis on laisse reposer pendant 15 min
(Solution mère).

3. Calcul du poids sec

 Après avoir mis dans un bécher un poids connu et précis de terre. On place celui ci au four
pasteur pendant un temps minimum de 6h à 180°C. Ainsi on s’affranchira du taux
d’hydratation de la terre qui varie en fonction des conditions atmosphériques et du lieu de
prélèvement. Ceci est nécessaire pour comparer des échantillons prélevés à des lieux
différents, puisqu’on ne prend plus en compte que la masse de la terre sèche.

4. Dilutions
Les microorganismes en suspension sont dilués en cascade de 10 -1 à 10-9.
 Transférer 1 mL de la suspension préparée précédemment (solution mère) dans le 1er
tube contenant 9 mL d’eau physiologique stérile qui constitue la dilution 10-1.
 Homogénéiser à l’aide d’un vortex et procéder de la même manière, en prélevant 1 mL
dans le tube 10-1 pour le transférer dans le tube 2, homogénéiser, et ainsi de suite.

5. Ensemencement
 Réaliser un étalement en surface de 0,1mL des différentes dilutions précédemment
préparées sur deux milieux de culture différents GN et EMB. (3 répétitions pour
chaque dilution), et incuber pendant 48h à 30 °C.
- Le milieu GN va servir à une multiplication non sélective des bactéries et la plupart
des microorganismes non exigeants
- Le milieu EMB va servir à la présélection des souches isolées d’entérobactéries

6. Dénombrement
Afin de dénombrer la flore microbienne sur milieu solide, il faut considérer que chaque
colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de
l’étalement. Vu que certains microorganismes peuvent être pluricellulaires, on ne peut
considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme
d’UFC (unité formant colonie) afin de rapporter le résultat obtenu. Pour cela :

 Après incubation, le nombre de colonies sur chaque boîte est comptabilisé grâce à un
compteur de colonies, et seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront
prises en comptes (Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte
n’étant pas statistiquement fiable).

7. Lecture
 Dénombrer les colonies bactériennes /boite de pétri /dilution.
 Calculez le nombre de bactéries par gramme de sol.

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II) Criblage et Purification des entérobactéries

 A partir des boites d’EMB, Repérer 3 colonies à « allure différentes » (vérifier
éventuellement l'allure microscopique par la réalisation d’un frottis à l’état frais, et
d’une coloration de Gram).
 Prélever un peu des colonies repérées à l’aide d’une anse de platine et les ensemencer
sur gélose EMB comme suit :

- Ensemencer par stries fines et très serrées le premier demi- cercle de la boite
- Flamber l’anse de platine, laisser refroidir
- Ensemencer le deuxième demi- cercle
- Flamber l’anse de platine
- Ensemencer le troisième demi-cercle
 Cultiver pendant 24h à 37°C.

Lecture
 Noter la morphologie (couleur, aspect, taille,...) des colonies bactériennes sur le milieu
EMB.
 les colonies bien séparées sont repiquées par stries sur gélose inclinée (GN) dans des
tubes à essais. Après incubation à 37°C pendant 24h, les souches bactériennes pures
sont stockées à 4°C.

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 ANNEXE

Compositions des différents milieux de cultures utilisés

Gélose nutritive (GN)

Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la
croissance d’une grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la
numération des microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières.

 Extrait de viande………………… 1,0 g/L

 Extrait de levure…………………. 2,5 g/L
 Peptone………………………….. 5,0 g/L
 Chlorure de sodium……………….5,0 g/L
 Agar……………………………... 15,0 g/L
 pH : 7,0

Gélose EMB (Eosin Methylene Blue)

La gélose EMB est constituée d’éosine et de bleu de méthylène qui sont des agents
« faiblement » sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des
microorganismes gram positifs tels que les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants
assurent la différenciation entre les germes lactose positifs et les germes lactose négatifs.

 Peptone……………………..………10,0 g/L
 Lactose……………….……….……. 10,0 g/L
 Eosine………………………….…….0,4 g/L
 Bleu de méthylène…………….… 0,0625 g/L
 Hydrogénophosphate de potassium…. 2,0 g/L
 Agar………………………………… 15,0 g/L
 pH : 6,8

Aspect de certains microorganismes sur milieu EMB :

- Colonies moyennes de couleur violet-vert brillant (dos de scarabée) : Escherichia
coli probable ;
- Colonies grosses 4 à 6 mm de diamètre, convexes, roses avec centre violet (aspect
en œil de poisson), muqueuses : Klebsiella (parfois Enterobacter) probables
- colonies violet pâle avec un centre et un reflet métallique peu
marqué : Citrobacter probables
- colonies bleuâtres : Entérobactéries
- colonies brunâtres : Klebsiella probables
- colonies ambrées transparentes : Salmonella ou Shigella probables
- colonies en forme de toile ou de plume : levures, Candida albicans probables.

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