Par Messaoui Naima

EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES

L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectu partir de
l'isolement aprs incubation. L'aspect des colonies dpend du milieu utilis de la
dure et de la temprature de l'incubation.
Il ne pourra tre dcrit convenablement qu' partir de colonies bien isoles : les
colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapproches.
La colonie peut apparatre la surface du milieu de culture pour les germes
arobies, ou tre en profondeur pour les germes anarobies

I. Aspect de colonies en surface sur milieu solide

1.1. La taille
Elle peut tre mesure l'aide d'une rgle gradue pour les grandes colonies. Il
est possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour
mesurer la taille des petites colonies en utilisant de micromtres oculaires..

1.2. La forme
Allure de contours : lisse, dentels, dchiquets, irrguliers
Relief : surface bombe, demi-bombe, plate.
Centre : parfois surlve, parfois ombilique (en creux)

1.3. L'aspect de la surface

La surface dune colonie bactrienne peut tre lisse, rugueux, renvoyer la lumire
de faon leur donner un reflet mtallique ou un aspect iris.

1.4. L'opacit
Les colonies sont dcrites comme :
Opaques (ne laissent pas passer la lumire)

 Translucides (laissent passer la lumire mais on ne voit pas les formes au

travers, comme le verre dpoli)
Transparentes (laissent passer la lumire et voir les formes au travers, comme
le verre, on parle de gouttes de rose"

1.5. La consistance
Au moment du prlvement il est possible d'apprcier si les colonies sont
grasses, crmeuses (on obtient facilement des suspensions homognes), sches
ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homognes).

1.6. La couleur et/ou pigment

Plusieurs colonies nont pas une couleur bien dfinie (blanc, gris). Par contre,
certaines bactries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien
caractristique la colonie (rose, jaune, rouge ), tendis que dautres produisent
un pigment soluble qui diffuse et colore le milieu.

2. Aspect des colonies en profondeur :

a) Colonies rgulires en formes de lentilles,
b) Colonies irrgulires de formes diffuses et floues.

3. Aspect des colonies en surface sur glose linaire

a) filiformes
b) lgrement envahissantes avec bords onduls
c) lgrement envahissantes avec bord rod
d) envahissante

Les formes des colonies en observation macroscopique

II. Aspect de la pousse en milieu liquide

Les bouillons nutritifs sont aussi utiliss pour cultiver les bactries. Dans un
bouillon la croissance microbienne se traduit par lapparition dun trouble ou
opalescence mais laspect varie selon les espces.

LEXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES

Lobservation microscopique permet de faire une tude morphologique des

cellules dune espce bactrienne. Elle comprend :

I. Examen ltat frais

Cest lexamen microscopique de bactries vivantes, en milieu liquide. Il permet
dapprcier leur mobilit (ou immobilit) et leur morphologie.

II. EXAMEN APRS COLORATION

Lexamen aprs coloration permet dobserver des bactries tues fixes sur une
lame et ayant subi laction dun ou plusieurs colorants. Les colorations, ralises
sur des frottis, sches et fixes, sont classes en :
o Coloration simple (un seul colorant)
o Coloration diffrentielle type Gram
o Colorations spciales des structures bactriennes (capsules, spors.).

REMARQUE :
La ralisation de frottis de bonne qualit est une condition pralable toute
coloration.

1. Ralisation des frottis :

Les frottis doivent tre tals en couche mince et rgulire, puis schs et fixs.

[list]

-Etalement sur lame de verre :

-Notez la rfrence de lchantillon sur une lame parfaitement propres et
dgraisses, 2. Prlevez strilement laide dune anse de platine une goutte de
culture bactrienne et talez un film mince,
-Schage :
Le schage est effectu laire libre jusqu ce que le frottis prsente un aspect
mat.
-Fixation du frottis sec :
Cette tape consiste tuer les bactries et les coller sur la lame, sans en altrer
la structure. La fixation seffectue par la chaleur :
-La lame, tenue par une pince (frottis situ sur le dessus) est passe 3ou 4 fois
dans
la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant dentreprendre une coloration.
-Fix le frottis en passant dlicatement et rapidement la lame 2-3 fois au-dessus
de la flamme

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I. COLORATIONS SIMPLES : (Coloration au bleu de Mthylne)

La coloration au bleu de mthylne peut apporter des informations concernant la
morphologie des germes.

Mode opratoire :
Sur le frottis fix et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de mthylne phniqu jusqu' ce que toute la
lame soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distille, ou
l'eau du

robinet jusqu' limination des colorants en excs.

- Scher l'air ou sur une platine chauffante, ou encore scher dlicatement
entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif immersion.

Rsultats
Les bactries sont colores en bleu sombre. Cette coloration est intressante
pour l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'tude de la
morphologie des bactries.

II. COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM

Cest la coloration de base en bactriologie qui permet de distinguer les bactries
en Gram positif et en Gram ngatif, cette distinction est fondamentale pour leur
identification. En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants
cytoplasmiques et aprs ce temps de coloration, toutes les bactries sont
violettes. Chez les bactries Gram ngatif, la paroi, riche en lipides, laisse
passer l'alcool (ou le mlange alcool + actone) qui dcolore le cytoplasme alors
que, chez les bactries Gram positif, la paroi constitue une barrire
impermable l'alcool et le cytoplasme demeure color en violet.

Ractifs :
- Violet de gentiane phnique
- Lugol (iodo-iodure de potassium)
- Alcool 95% (ou mlange alcool absolu+ 1/5me dactone)
- Safranine (ou Fuchsine phnique de ziehl)

Mode opratoire :
1. Raliser un frottis et le fixer la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir le
Lugol environ 1 min

4. Jeter le Lugol et faire couler de lalcool sur la prparation ; rincer

immdiatement leau
5. Recouvrir la prparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver
abondamment.
6. Scher au-dessus de la flamme dun bec Bunsen.

Rsultats:
A lissue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactries colores en violet fonc ; elles ont gard le violet, le gram elle
sont ddites Gram positif ;
- Des bactries colores en rose ou rouge ple ; elles ont perdu le violet, le
Gram elles sont dites gram ngatif.

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Diffrence entre bactries Gram+ et bactries Gram-

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