Plant du travail 

:
1-Introduction.
2-Principe du TP.
3-But du TP.
4-Partie théorique.
5-Mode opératoire :
-Matériels utilisé.
-Produits utilisés.
6-Partie expérimental :
-Protocole.
7-Résultats.
8-Conclusion.
 Introduction  :
La coloration différentielle ou coloration de gram est l’étape essentielle de l’identification bactérienne,
surtout dans le domaine médical, à partir d’une culture pure
(Culture pure contenant une seule espèce), elle est aussi appelée coloration :
V.L.A.F (V violet, L lugol, A alcool, F fuschine) La coloration de gram est un caractère «
Tinctorial»
C’est à dire l’affinité de la cellule bactérienne à se colorer. La coloration de Gram doit son nom
au bactériologiste danois Hans Christian Gram
 Qui a mis au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en
évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces
Propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une
information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le
type que sur la forme 

But de TP  :
Il permet l’étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration. La
coloration de GRAM permet de différencier des bactéries dites Gram + de bactéries
dites Gram -.
Cette méthode permet d'observer :
-    la MORPHOLOGIE des bactéries
-    le MODE de GROUPEMENT
-    la COULEUR : gram + ou -
-    la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de mélange
Principe de TP  :
La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le
cristal violet, d'iode puis d'un mélange d’alcool et d'acétone. Dans un premier temps, le
colorant pénètre dans la paroi et le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode réagit avec le
colorant et le rend insoluble. La perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif  à
l'alcool permet la décoloration. Les bactéries à Gram positif  restent colorées en violet ou
mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose) permet de visualiser à nouveau, les
corps cellulaires des bactéries à Gram négatif
 Partie théorique  :

Le frottis : C'est l'étalement, sur une lame de verre, d'un liquide ou de cellules prélevées
par grattage, pour permettre leur examen au microscope après coloration appropriée.
Coloration de gram : La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée
en bactériologie médicale ; elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à
l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fushine
(Gram -). L'intérêt de cette coloration est de donner une information rapide et
médicalement importante.
Le violet de gentiane : violet de gentiane est le nom commun donné au mélange
de méthyl violets 2B, 6B et 10B selon que la molécule contient 4, 5 ou 6 groupements
méthyle. On appelle parfois cristal violet ou violet de Paris le méthyl violet 10B, tandis
que le méthyl violet 2B est connu en tant que violet de méthyle. C'est un colorant de
couleur violette, d'autant plus foncée que le nombre de groupements méthyle augmente,
utilisé surtout en microbiologie
Mode opératoire :
Matérielle utilisée  :
-Une lame.
-Une anse de platine.
-pipette pasteur.
-Un bec bunsen.
-Un microscope photonique.
Produits utilisée  :
-Violet de Gentiane.
-  lugol.
-l’alcool.
-la fushine.
-L’eau distilé
Partie pratique :

1-préparation de frottis :
Sur une lame de déposer une goutte d’eau distillé, Ajouter avec l’anse de platine
stérilisée une goutte de la colonie isolée 
2-étalement de frottis :
Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de la lame

2-séchage :
laisser séché à l’aire.

3-fixation :
Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec bunsen .La face de la lame opposé à
l’étalement
4-observation sous mi
croscope :

Résultat :

Apparition des bactérie isolée

2-coloration de grame :
1-préparation de frottis
2-coloration avec le violet de gentiane.

3-laisser 1 min.
4-Lavage avec l’eau distillée.

5-coloration avec le lugole.

On le laisse 1 min

6-lavage avec l’eau distilée.

7-décoloration avec l’alcool.

8-coloration avec la fushine.

9-lavage avec l’eau distillée.

10-OBSERVATION SOUS MICROSCOPE :

Résultat :

Apparition des bactéries de gram négative

Les bactéries sont isolée de forme sphérique cocci.

Conclusion  :
D’après les résultats qu’on a obtenu on peut déduire que l’examen microscopique à l’état
frais permet de mettre en évidence les caractéristique des bactéries observées : la forme, la
mobilité, le mode d’assemblage, et permet aussi l’identification et l’orientation bactérienne.