2ème année des

classes
préparatoires

TP 2:
Examen microscopique

Année universitaire: 2023-2024

INTRODUCTION

Examen microscopique

L’examen microscopique apparait comme la première étape de

l’étude d’une bactérie, il comprend :

I. Examen microscopique à l’état frais

II. Examen microscopique après coloration

INTRODUCTION

L’examen à l’état frais: l’examen entre lame et lamelle des bactéries

vivantes.

L’examen après coloration: les colorations effectuées le plus souvent

sur des frottis séchés et fixés, peuvent être classées en:

Coloration usuelle: coloration simple, coloration de Gram.

Coloration spéciale: qui permet la mise en évidence des détails de la

structure bactérienne: flagelles, capsules, spores,…
 OBJECTIFS/ BUT DU TP

 Apprendre à utiliser un microscope optique et à manipuler les lames et

lamelles

 Maîtriser les techniques de coloration microscopique

 MATÉRIELS/VERRERIES/
PRODUITS/CONSOMMABLES
Matériels Produits

Lames Souches de référence :

Lamelle *Staphylococcus aureus,
L’anse *Streptococcus sp,
Bec Bunsen *Escherichia coli
Microscopes optiques *Pseudomonas aeruginosa
Huile à immersion Lactobacillus sp,
Pissette *Saccharomyces cerevisiae
(cultures jeunes).
Colorants : Violet de gentiane,
lugol, fuschine, éthanol, l’encre de
Chine, mordant de Rhodes, nitrate
d’argent ammoniacal, eau distillée.
 I. Examen microscopique à l’état frais

 BUT :

Il permet d'observer :
•Morphologie des bactéries
•Pureté
•Mobilité
  TECHNIQUE

1-A partir d’une culture liquide

Prélever une goutte de suspension à l’anse de platine à boucle.

Déposer la goutte de culture au milieu d’une lame (la lame doit être
propre et sèche),

 Déposer délicatement la lamelle,

 Réaliser une première observation avec un objectif faible puis

l’objectif x 40.
  TECHNIQUE
2- A partir d’un milieu solide
Déposer une goutte d’eau distillée stérile au centre de la lame (la lame doit être
propre et sèche),

Prélever une fraction d'une colonie cultivée préalablement sur milieu gélosé,

Faire une suspension homogène dans la goutte d’eau en incorporant

progressivement la colonie et en remuant très délicatement,

 Déposer délicatement une lamelle,

 Réaliser une première observation avec un objectif faible puis l’objectif x 40.
 Préparation correcte.
Le liquide est bien réparti
Préparation incorrecte. Présence de beaucoup de bulle
Recommencer d’air.
Elles ne doivent pas apparaître
sur le champ montrer.

 OBSERVATION

 Les bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très
différents sont observés (déplacement dans toutes les directions).
II. Examen microscopique après coloration/ l’état fixé

Les différents frottis réalisés traités par des colorants:

Coloration simple
coloration au bleu de méthylène:
peut apporter des informations
concernant la morphologie des germes

Coloration différentielle
coloration de Gram
II. Examen microscopique après coloration/ l’état fixé

 BUT :

Il permet d'observer :

•Morphologie des bactéries

•Mode de groupement
•Pureté
 Réalisation d’un frottis
Etalement:
•Nettoyer une lame à l'alcool.
•Déposer une goutte de suspension sur cette lame
•Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de la lame (à l’aide de
l’anse)
 Réalisation d’un frottis
Séchage:
•Maintenir la préparation dans l’air chaud au-dessus de la flamme du bec Bunsen, à hauteur
suffisante.

Fixation:
•Passer la lame -frottis situé sur le dessus- dans la flamme chauffante, LENTEMENT et 3 à 4
fois de suite et laisser refroidir.
 Coloration simple
•Coloration au bleu de toluidine
•Coloration au bleu de méthylène
•Coloration à la fuschine phénique de Ziehl

 TECHNIQUE
 Verser quelques gouttes de colorant sur la lame ( frottis préparé) 1-2 min
 Laver à l’eau distillée
 Sécher dans la flamme d’un bec Bunsen
 Examiner au microscope à l’objectif à immersion
 Coloration de Gram

 Principe :

 Cette coloration est une coloration qui permet de différencier les bactéries
d'après leur forme et leur affinité pour les colorants.

 La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM–

grâce à leurs différences de nature de paroi.
 Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en lipides,
 Les bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.
Définition/Principe de la technique

Composition des parois des Gram +/-.

  LES ÉTAPES DE LA COLORATION DE GRAM

LES REACTIFS

 
1 colorant
er
2ème colorant :
Violet de Gentiane
Violet

Fuschine
Liquide
de
de Alcool à 95°
gentiane
lugol Fuschine

ou
Safranine

 
Un fixateur ou mordant : Un décolorant :
solution Lugol Alcool absolu
(Solution iodée)
  TECHNIQUE
Recouvrir la lame de cristal violet ou violet de gentiane (1 minute)
Rincer à l’eau distillée
Recouvrir de Lugol (de 30 secondes à 1 min)
Rincer à l’eau distillée et l’égoutter
Décolorer à l’alcool « Ethanol» (15 à 30 sec).
Rincer immédiatement à l’eau distillée et égoutter
Recouvrir la lame de fuschine (20 sec)
Rincer à l’eau distillée
Sécher au dessus de la flamme du bec Bunsen
Examiner au microscope à l’objectif à immersion
 1-La coloration primaire

 Recouvrir de violet de Gentiane en

H2O
versant le colorant en bout de lame
et en le faisant glisser le long de la
lame.

Laisser agir pendant 1 minute.

 Rincer à l'eau pour éliminer l’excédent de

colorant
 2- Le Mordançage ou fixation au Lugol

 Pencher la lame et éliminer

le violet de gentiane en
faisant couler sur la lame la
solution de Lugol

 Laisser agir pendant 30 sec

à 1 minute
H2
O

 Rincer à l'eau pour éliminer

l’excédent de Lugol
 3- La décoloration à l’alcool

Al
co
ol
 Verser quelques gouttes d’alcool sur le frottis
 15 à 30 secondes environ

H2
O  Rincer avec un jet de
pissette d’eau
4- La coloration secondaire

 Recolorer par de la fuschine en

versant le colorant en bout de
lame et en le faisant glisser le long
de la lame.
Ne pas verser la fuschine sur le frottis
pour éviter une coloration trop intense

 Laisser agir pendant 20

secondes.

 Rincer avec un jet de pissette d’eau

 Laisser sécher
 ETAPES RÔLES Gram + Gram -
Avant la
coloration
Le violet de gentiane traverse la
Etape 1 Coloration paroi et les membranes des
primaire bactéries
Violet de gentiane puis colore le cytoplasme
Le Lugol provoque une
combinaison chimique entre le
violet de gentiane et les
Fixation composants cytoplasmiques
Etape 2
par des bactéries et fixe ainsi la
le Lugol coloration dans le cytoplasme.
Tous les éléments sont
colorés en violet / noir.
L’alcool traverse uniquement la
Décoloration paroi des bactéries gram –
Etape 3
à l’alcool et décolore le cytoplasme

Coloration La fuschine traverse la paroi des

Etape 4 bactéries gram – et gram +
secondaire
et colore le cytoplasme
Fuschine
 RÉSULTATS/ANALYSES

La coloration de Gram permet de classer les bactéries en deux grandes catégories :

 Les bactéries Gram positif qui gardent leur coloration violette après décoloration par l’alcool.
 Les bactéries Gram négatif qui décolorées par l’alcool sont teintées par la fuschine et apparaissent

roses ou rouges.

Les bactéries à Gram positif et Gram négatif (Gram, forme, mode d’association)
  RÉSULTATS APRÈS COLORATION
Forme d’une cellule bactérienne :

On distingue principalement des formes:

Sphériques (cocci),

Cylindriques (bacille),

Spiralées (spirille),enroulées (spirochète) ou filamenteuses.

Mode de regroupement

Elles peuvent se regrouper:

En chaînes ( ex: Streptococcus),

En amas asymétriques ou grappes (ex: Staphylococcus),

En amas cubiques réguliers (ex: Sarcina),

En palissades ou en forme de lettre chinoise ou en paquets d’épingles (ex: Corynebacterium).

La forme sphérique La forme cylindrique La forme spiralée
 PROTOCOLE/MODE OPÉRATOIRE
3) Coloration spéciale/Capsules:
Coloration des capsules:
o•Déposer sur une lame propre, soit une goutte de culture en milieu liquide, soit
une goutte d’eau distillée dans laquelle on dissociera une parcelle de colonie.
o• Déposer à côté une petite goutte d’encre de Chine.
o• Recouvrir d’une lamelle (les deux gouttes se mélangent).
o• Examiner la préparation à l’objectif x 40, en particulier dans la zone où l’encre
de Chine est diluée sans trop l’être (contraste adéquat).
 PROTOCOLE/MODE OPÉRATOIRE
3) Coloration spéciale/ Flagelles:
 Les flagelles sont fragiles et la préparation du frottis est délicate:
Un frottis réalisé selon la technique classique casserait les flagelles. On laisse couler, sur
la lame inclinée à 45° au-dessus de la cuve à coloration (mettre de l’eau de Javel dans la cuve), 2
gouttes d’une culture en bouillon (culture jeune : 6 à 12 heures) de la souche à étudier. Laisser sécher

Coloration des flagelles par la méthode de Rhodes :

o• Recouvrir la préparation de mordant de Rhodes (préparé extemporanément) pendant 3 min.

o• Laver soigneusement à l’eau distillée.
o• Recouvrir de nitrate d’argent ammoniacal (préparé extemporanément), chauffé presqu’à
ébullition, et laisser agir 3 à 5 min.
o• Rincer à l’eau distillée.
o• Sécher et observer à l’immersion.
 RÉSULTATS/ANALYSES
2) La capsule:
Les bactéries, produisant dans certaines conditions des substances visqueuses qui peuvent
entourer une cellule bactérienne ou quelques cellules, sont alors dites encapsulées.
Les capsules bactériennes se présentent sous forme de halos clairs qui enveloppent
les cellules bactériennes plus au moins réfringentes et qui contrastent avec le fond grisé de
la préparation. Ces halos clairs doivent demeurer quelle que soit la mise au point

L’ aspect de la capsule sous le microscope

 RÉSULTATS/ANALYSES
3) Les flagelles:
Les corps bactériens apparaissent presque noirs, les flagelles sont teintés en brun
plus ou moins foncé. Selon leur disposition autour de la bactérie, on distingue :
 CONCLUSION

A la fin du TP l’étudiant sera capable de réaliser un frottis et une

préparation à l’état frais, comme il peut identifier le microorganisme

par observation microscopique après coloration, tout en déterminant le

Gram, le mode d’association et la forme des cellules bactériennes, et les

autres organites tels que la capsule et les flagelles s’ils existent.