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Technique
microbiologique Coloration de Gram | Principe | Procedure | Interprétation |
Astuces
🏾 Contenu :
Ⅰ. Définition
Ⅱ. Principe de la coloration
Ⅲ. Composition et préparation des colorants
Ⅳ. Les étapes
Ⅴ. Contrôle de qualité
Ⅵ. Commentaires et conseils #ASM
Ⅰ. Définition
Qu'est-ce qui fait que certaines bactéries retiennent le violet gentiane (Gram positif) tandis que
d'autres libèrent facilement le colorant lorsqu'on ajoute de l'alcool (Gram négatif) ?
Les parois des bactéries à Gram négatif ont un taux élevé de lipides (à cause de la membrane
externe) et une fine couche de peptidoglycane. L'alcool contenu dans le décolorant extrait le lipide,
ce qui rend la paroi des bactéries à Gram négatif plus poreuse, et incapable de retenir le complexe
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violet-lugol, décolorant ainsi la bactérie. Le peptidoglycane plus épais et le degré de réticulation
plus élevé piège le complexe violet-lugol plus efficacement, ce qui rend la paroi Gram positif
moins sensible à la décoloration.
De plus, la coloration Gram-positive et Gram-négative des bactéries révèle la morphologie globale des
bactéries, de sorte que les bactéries peuvent également être étiquetées en tant que bacilles ou cocci.
Globalement :
- Solution de safranine : safranine O :25 g ; éthanol à 95 °GL : 100 ml ; solution aqueuse d’oxalate
d’ammonium à 25 g/l : 800 ml ;
- ou fuchsine pour Gram : fuchsine de Ziehl = fuchsine basique : 10 g ; phénol : 50 g ; éthanol : 100 ml
; eau distillée : 1 l. Diluer au 1/10° pour la fuchsine pour GRAM ;
Conservation :
- En flacon hermétique, à l’abri de la lumière, de préférence au frais : plus de 3 ans sauf pour la
fuchsine diluée.
- Attention : filtrer lorsque l’on rempli les flacons pour l’utilisation quotidienne à partir des flacon de
réserve.
Ⅳ. Les étapes
• Quelle que soit le colorant utilisé la technique reste sensiblement la même comme suite:
❶ Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute avec le réactif de
coloration au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis (concentration cellulaire
trop lourde ou trop légère) affectera les résultats de la coloration.
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❷ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes
❸ Inondation avec le mordant : iode ou lugol. Attendez 1 minute
❹ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes.
❺ Inondation la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte à
goutte pour faire sortir l’agent de décoloration
À la fin , les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram positif
tacheront le bleu / violet.
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- Il faut cependant savoir que la coloration de Gram peut être variable pour une même espèce (par
exemple, le pneumocoque se décolore facilement, de même, certaines bactéries Gram positif quand
les colonies sont âgées).
- Certaines bactéries sont même dites « Gram faible » ou « Gram variable » (ex: corynébactéries).
☰ Risques d’erreurs
- Attention, une mauvaise coloration peut conduire à des erreurs d’identification bactérienne ou à une
mauvaise orientation de diagnostic.
Faux positif
Faux négatif
Ⅴ. Contrôle de qualité
- Etalez une mince couche de selles sur une lame et colorez là. Il doit apparaître de nombreuses
bactéries Gram positif et négatif.
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☰ Remarque : Il est recommandé
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de réaliser, avec la même préparation de selles diluées, une ou
plusieurs dizaines de lames que l’on sèche, que l’on fixe et qu’on emballe séparément avec du papier
aluminium . On les conserve à +4°C. Cela permet d’éliminer le paramètre : épaisseur du frottis et de
se concentrer sur la qualité des réactifs et sur les temps de coloration et de décoloration.
- L'épaisseur du frottis utilisé affectera le résultat de la coloration. L'étape la plus cruciale pour obtenir
le résultat de la coloration est l'étape de décoloration.
- Une décoloration excessive entraînera un résultat erroné où les frottis Gram positives peuvent
apparaître rose ou rouge indiquant un résultat Gram négatif, et une décoloration insuffisante conduira
à un résultat erroné où les frottis Gram négatives peuvent apparaître de bleu à violet indiquant un
Gram positif.
- Le groupe ( #ASM ) recommande que les cellules soient préparées avec un frottis mince sans zones
d'agglutination ou d'incohérence. Lors de la coloration du frottis mince, un court temps de
décoloration doit être utilisé.
- Il est recommandé d'utiliser de jeunes cultures en croissance active . Une paroi cellulaire intacte est
requise pour une précise. Les cultures plus anciennes peuvent avoir des cassures dans la paroi
cellulaire et donnent souvent des résultats à Gram variable où un mélange de cellules
- Lors de la visualisation des diapositives, utilisez la microscopie à fond clair et ajustez suffisamment
la luminosité pour révéler la couleur de l'échantillon.
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3% de KOH et libèrent à leur tour un matériau
chromosomique viscoïde qui fait que la suspension
devient épaisse et filandreuse.)
Description du
Morphotype Organismes les plus courants
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Description du
Morphotype Organismes les plus courants
Petit Haemophilus, Legionella (thin with filaments), Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Francisella,
Pasteurella, Capnocytophaga, Prevotella, Eikenella spp.
R : La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram (1853 – 1938)
qui mis au point le protocole de la coloration en 1884.
R : La coloration de Gram consiste à colorer les bactéries, à fixer la couleur avec un mordant, à
décolorer les bactéries et à appliquer une contre-coloration.
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Pour certains auteurs, ils considèrent qu'il y a 5 étapes de coloration de Gram dont la première est la
réalisation d'un frottis de bactéries sur une lame, puis la coloration des bactéries, la fixation, la
décoloration et enfin la contre-coloration.
R :Elle est dite une coloration différentielle parce qu’elle permet de différencier les bactéries selon 2
critères principaux : leur forme (paires, tétrades, groupes, chaînes...) et leur affinité pour les colorants
(: gram-positif et gram-négatif).
R :L'iode est ajouté comme mordant pour la fixation du colorant, il former le complexe cristal violet-
iode afin que le colorant ne puisse pas être éliminé.
R : Les parois cellulaires à Gram négatif contiennent une forte concentration de lipides solubles dans
l'alcool. Le décolorant dissout les lipides, augmentant la perméabilité de la paroi cellulaire et
permettant au complexe cristal violet-iode de s'écouler hors de la cellule.
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Reference
1. Gram staining
2. Differential staining of bacteria: gram stain
3. ASM - Gram Stain Protocols
4. Jay Hardy - Gram’s Serendipitous Stain
5. Nishant Tripathi; Amit Sapra - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562156/
. Andreia Popescu - The Gram Stain after More than a Century
7. Clinical Microbiology Procedures Handbook 4ed
. TEXtBOOK Diagnostic Microbiology 4ed
9. T J Beveridge - Mechanism of gram variability in select bacteria
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