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II. Techniques de coloration :

Les colorations bactériennes sont nombreuses et sont réalisées à l’aide de colorants dont les
plus communs sont des sels divers, appliqués selon des protocoles spécifiques et rigoureux sur des
frottis bactériens, on distingue deux types de colorations :
II.1- Les colorations simples :
Elles sont obtenues par l’utilisation d’un seul colorant acide ou basique. Les colorants basiques
sont composés de l’association d’un cation coloré et d’un anion incolore (ex : chlorure– de bleu de
méthylène+), alors que c’est l’inverse pour les colorants acides (ex : eosinate– de sodium+). Ces types
de colorants sont fréquemment utilisés pour déterminer la forme, la taille et le type de regroupement
des cellules bactériennes. Ils se fixent le plus souvent sur les structures cellulaires par interaction
ioniques. C’est en particulier le cas des colorants basiques dont la charge positive se fixe combine aux
groupements phosphates des acides nucléiques cellulaires, chargés négativement.
Exemple : la coloration au bleu de méthylène pour mettre en évidence la forme, la taille et le mode de
regroupement des cellules bactériennes (Figure 1).

Figure 1 :

La forme et le
mode de
regroupement
des cellules
bactériennes.

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II.2- Les colorations différentielles :

Elles permettent de séparer les bactéries en groupes distincts, sur la base de propriétés
spécifiques de coloration. C’est le cas par exemple de la coloration de Gram ou encore la coloration
acido-alcoolo-résistante qui est utilisé pour identifier les mycobactéries dont Mycobacterium
tuberculosis (agent de la tuberculose) et Mycobacterium leprae (agent de la lèpre) et qui sont les plus
importantes en microbiologie.
II.2.1- Coloration de Gram (Gram Stain) :

Cette coloration a
été développée par
Christian GRAM en 1884
de manière fortuite. Elle
permet de mettre en
évidence une organisation
structurale différente de la
paroi bactérienne.
Ce caractère s’est
révélé, par la suite tout à
fait fondamental et a été à la
base de la classification
phénétique des bactéries en
en division (précédente
classification de BERGEY’s
Manual), dont deux
divisions spécifiquement
mises en évidence par la
coloration de Gram : les
bactéries à Gram négatif et
les bactéries à Gram positif
(Figure 2 et 3).

Figure 2 : Structure chimique de la paroi bactérienne chez les bactéries à GRAM négatif et Gram
positif.

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Figure 3 : Structure de la paroi cellulaire des bactéries Gram

positive et Gram négative.
II.2.1.1- Principe de la coloration :
La réaction différente des bactéries vis-à-vis de la coloration de Gram s’explique par une
différence d’accessibilité de leurs cellules, déterminées par la structure et la composition spécifique
des parois cellulaires de chacun des deux groupes de bactéries. La coloration de Gram caractérise la
composition et la structure chimique de la paroi des bactéries. Les bactéries à Gram négatif ont une
paroi peu épaisse composée d’une mince couche de peptidoglycane surmontée d’une membrane
externe très riche en lipides alors que la paroi des bactéries à Gram positif possède uniquement une
couche de peptidoglycane mais en moyenne cinq fois plus épaisse et dépourvue de composants
lipidiques significatifs (Figure 2 et 3).
Le colorant et le mordant utilisés (violet de gentiane et lugol) pénètrent séparément les deux
types de cellules et forment dans leur cytoplasme des complexes colorants stables (complexes violet-
iode) qui donnent aux bactéries une coloration violette.

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Dans un premier temps, le

colorant primaire (violet de
gentiane) pénètre sans distinction
toutes les bactéries et colore leur
cytoplasme. En seconde étape,
l’iode contenu dans lugol utilisé
comme mordant réagit à la fois
avec les composés cellulaires et
avec le violet de gentiane pour
former des complexes colorant
iodo-iodurés violets qui sont des
cristaux insolubles et relativement
volumineux. Cette situation
survient quelle que soit la nature
de la paroi bactérienne. L’étape
décisive de la décoloration aux
solvants organiques, souvent de
l’éthanol à 95° détermine la nature Figure 4 : Les étapes de la coloration de Gram
de la paroi bactérienne.

 Chez les bactéries à Gram négatif, l’éthanol mis en contact des cellules colorées solubilise les
lipides de la membrane externe de leur paroi et aménage des pores dans leur mince couche de
peptidoglycane, avant de pénétrer leur cytoplasme. Les complexes colorants cytoplasmiques
diffusent alors librement à travers la paroi rendue poreuse et les bactéries perdent leur couleur
violette initiale. Les cellules ainsi décolorées deviennent invisibles mais elles sont accessibles
et absorbent en phase suivante de contre-coloration la safranine ou la fuschine qui les
recolorent alors en rose, permettant ainsi leur visualisation au microscope.
 Par contre, la paroi des bactéries à Gram positif est très pauvre en lipides et de ce fait bien
moins sensible de l’action de l’alcool. De plus l’éthanol a pour effet de déshydrater l’épaisse
couche de peptidoglycane la rendant encore plus imperméable aux cristaux colorants fixés dans
le cytoplasme. Ces bactéries gardent alors leur coloration initiale violette, résultant de la
fixation dans le cytoplasme des complexes colorés formés par le violet de gentiane et
solubilisés par l’iode de lugol (Figure 4).

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II.2.1.2- Protocole de la coloration :

La coloration de Gram peut être obtenue selon divers protocoles normalisés basés tous sur mêmes
principes et la même chronologie : fixation de l’échantillon, décoloration, et contre coloration :

1- Fixation du frottis de la suspension bactérienne par séchage à la chaleur douce sur une lame
porte objet en verre, après son étalement préalable.
2- Coloration primaire au violet de gentiane par la couverture totale de la lame pendant 1 minute.
3- Lavage à l’eau sans éponger.
4- Stabilisation de la coloration au lugol (qualifié d’agent mordant) par la couverture totale de la
lame pendant 1 minute.
5- Lavage à l’eau pour éliminer l’excédent d’iode sans éponger
6- Décoloration au goutte à goutte à l’éthanol à 95° avec une légère agitation jusqu’à l’élimination
du colorant (30s).
7- Contre coloration pendant 20 à 30 minutes par la couverture totale de la lame par une solution
de la safranine à 2.5% dans de l’éthanol à 95% ou la fuschine diluée à 10%.
8- Lavage à l’eau.
9- La lame une fois séchée, peut être observée au microscope optique avec un objectif à
immersion. Les bactéries à Gram positif apparaissent en violet et les bactéries à Gram négatif
en rose.

II.2.2- Coloration de Ziehl Neelsen ou coloration acido-alcoolo-résistante (Acid-Fast Staining) :

II.2.2.1- Principe de la coloration :
C’est une coloration différentielle utilisée pour l’identification directe et spécifique au
microscope optique des bactéries acido-alcoolo-résistante (BAAR) du genre Mycobacterium (dont M.
tuberculosis et M. leprae) et les espèces pathogènes du genre Nocardia (agents d’infections
respiratoires). Les bactéries se caractérisent par une paroi ayant des constituants lipidiques à très
longues chaines d’acides gras (>C32), formants des cires compactes insensibles à l’action corrosive d
et décolorante des acides et des solvants organiques. Le procédé consiste, selon un protocole
spécifique, à colorer un frottis bactérien à la fuschine, l’échantillon est alors soumis à une décoloration
par une solution mixte acide-alcool. Les BAAR demeurent colorées en rouge car leur paroi résiste au
traitement et la fuschine a une plus grande affinité de solubilisation dans les lipides de leur paroi. Par
contre chez les autres bactéries la coloration rouge est rapidement éliminée par l’action de la solution
acide-alcool et deviennent incolores. Une contre coloration au bleu de méthylène permet de bien
visualiser ces bactéries.

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II.2.2.2- Protocole de la coloration :

Avant de commencer la coloration on doit préparer un frottis bactérien, puis on procède à la
coloration :
1- Fixer le frottis par l’alcool pendant 05 minutes ;
2- 10 minutes de coloration à la fuschine phéniquée à 1% à chaude trois fois à émission de vapeur
3- Laver à l’eau ;
4- Décolorer pendant deux minutes en recouvrant d’acide sulfurique au 1/4 ;
5- Laver à l’eau ;
6- Décolorer pendant 05 minutes à l’alcool à 95° ;
7- Laver à l’eau ;
8- Colorer au bleu de méthylène phéniqué pendant 30 secondes ;
9- Laver à l’eau ;
10- Examiner à immersion.
Pour l’expression des résultats, chaque champ microscopique est examiné soigneusement 2 à 5
secondes. Les mycobactéries apparaissent comme de fins bacilles rouges soit isolés soit par deux ou en
amas plus ou moins importants mais très dense. Le fond de la lame est bleu. Les résultats sont
formulés comme suite :
1- Résultat positif :
Si supérieur à un (01) bacille/champ microscopique : présence de N BAAR/champs (résultat établi
pour 10 à 20 champs microscopiques).
Exemple : 03BAAR/champs (sur 20 champs).
Si inférieur à un (01) bacille/champs : présence de N pour 10 ou 20 champs microscopiques.
Exemple : 04 BAAR sur 10 champs microscopiques.
2- Résultat négatif :
Absence de BAAR sur X champs examinés.
II.2.2.3- Coloration pour microscopie en fluorescence :
On utilise un fluorochrome, l’auramine, après traitement à l’acide et l’acide et l’alcool, les
mycobactéries gardent la coloration à l’auramine et on contre coloration par le rouge thiazine. On
observe au microscope à fluorescence. Comme technique :
1- Couvrir le frottis avec l’auramine phéniquée pendant 15 minutes ;
2- Rincer à l’eau ordinaire ;
3- Recouvrir la lame d’acide-alcool pendant 02 minutes ;
4- Rincer ;
5- Contre colorer pendant 02 minutes ;
6- Rincer et sécher.

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7- L’examen se fait au microscope à fluorescence en lumière ultra-violette ;

8- Rechercher les bacilles fluorescents d’abord au faible grossissement (x25), puis contrôler la
morphologie avec un plus fort grossissement (x40). Examiner l’ensemble du frottis, les BAAR
émettent une lumière fluorescente jaune-vert due à l’auramine, sur un fond rouge. Les résultats
sont exprimés selon le model suivant :
Nombre de BAAR observés Notation.
0 sur 300 champs Négative.
1 à 2 sur 300 champs Nombre observé.
1 à 10 sur 100 champs Nombre/100 champs.
1 à 10 sur 10 champs Nombre/10 champs.
1 à 10 /champs Nombre/champs.
10 ou plus/champs supérieur à 10/champ.

II.2.3- Coloration des spores (Endospore Staining) :

Certaines espèces bactériennes, et plus particulièrement le genre Bacillus et Clostridium, ont la
propriété de former des spores, forme de résistance de ces bactéries en particulier vis-à-vis de la
chaleur et de la déshydratation, capables de redonner des bacilles.
La sporulation survient lorsque les conditions du milieu deviennent défavorables : milieu pauvre,
cultures âgées, déshydratation… etc. Les spores, très imperméables, sont parfois visibles à la
coloration de Gram sous la forme de zones incolores bien délimitées dans les bactéries ou à l’extérieur.
Elles apparaissent très réfringentes à l’état frais (figure 5).

Figure 5 : formation d’une spore Figure 6 : localisation d’une spore

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On peut toutefois les colorer par les méthodes décrites ci-dessous :

 Coloration positive :

Il existe différentes colorations basées sur la même technique : Afin de colorer la spore, on utilise
en combinaison l’action de la chaleur et une forte concentration de colorant. Nous allons décrire
la coloration à la verte malachite.
- Réaliser un frottis et le fixer
- Coloration : Recouvrir d’une solution de verte malachite à 5%. Chauffer jusqu'à émission de
vapeurs. Laisser refroidir et chauffer à nouveau. L’opération doit durer 5 à10 minutes
- Epreuve : Laver soigneusement
- Contre coloration : Recouvrir la lame de safranine ou de mercurochrome à 5 % pendant 30sec
à1 minute
- Laver, sécher entre deux feuilles de papier absorbant
- Observer à l’objectif 100 à immersion
Les spores apparaissent en vert foncés, les sporanges en vert pâle et les corps bactériens en rose.

Spores colorées en vert

Figure 7: spores bactériennes.

 Coloration négative :
On peut plus simplement mettre en évidence les spores bactériennes dans les corps bactériens en
faisant une coloration dite « négative ». En effet, cette fois la spore n’est pas colorée et reste donc
incolore dans un corps bactérien coloré. La coloration la plus utilisée dans ce cas est la coloration au
bleu de méthylène simple :
- Réaliser un frottis et le fixer ;
- Recouvrir la lame de bleu de méthylène phéniqué pendant 1 minute ;

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- Rincer à l’eau du robinet ;

- Sécher entre deux feuilles de papier absorbant ;
- Observer à l’objectif 100 à immersion ;
Les spores apparaissent incolores dans des corps bactériens bleus.

Spores incolores

Figure 8: spores bactériennes.

NB : Les spores bactériennes peuvent être observées par une simple coloration de Gram.

II.2.4- Coloration de la capsule :

II.2.4.1- Anthony’s Capsule Staining Method:

Figure 9: schéma d’une capsule bactérienne.

 III.2.4.1- Principe :
De nombreuses bactéries ont une couche gluante qui les entourent qui est habituellement appelé une
capsule. La composition de la capsule, ainsi que son épaisseur, varie avec chaque espèce bactérienne.
Les polysaccharides, des polypeptides et des glycoprotéines ont tous été trouvés dans des capsules.
Souvent, un agent pathogène avec une capsule épaisse sera plus virulent qu'une souche avec une
capsule peu épaisse ou n'a pas de capsule qui protège la bactérie contre l'activité phagocytaire des
cellules phagocytaires de l'hôte. Cependant, on ne peut pas toujours déterminer si une capsule est
présente par simple procédure de coloration, comme l'utilisation coloration négative. Dans la procédure
de coloration on utilise deux réactifs, le premier réactif est le cristal violet qui donne à la cellule et son matériel

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capsulaire une couleur violet foncé. Contrairement à la cellule, la capsule est non ionique et le colorant primaire
ne peut pas adhérer. Le sulfate de cuivre est un agent décolorant. Il élimine l'excès du colorant primaires ainsi
que la couleur de la capsule. Dans le même temps, le sulfate de cuivre agit comme un contre-colorant, être
absorbé par la capsule en se tournant en bleu clair ou rose, dans cette procédure le frottis ne doit pas être fixé à
la chaleur.
 II.2.4.2- Protocole de la coloration :
1- Préparer un frottis bactérien aseptiquement et laisser la lame sécher à l’air, ne pas sécher la
lame par la chaleur, elle peut causer un rétrécissement de la capsule ;
2- Recouvrir la lame par le cristal violet et laisser reposer de 4 à 7 minutes ;
3- Rincer soigneusement par le sulfate de cuivre à 20% ;
4- Sécher avec un papier absorbant ;
5- Examiner à immersion les capsules apparaisse sous forme d’un halo claire autour des cellules
sombres.

Figure 10 : observation microscopiques des capsules bactériennes.

(Klebsiella pneumoniae capsules; light micrograph
(×1,000). Capsules appear as white halos around red backgrounds).

II.2.4.2- Graham and Evans method

1. Sur une lame propre mélanger quelques gouttes de la suspension bactérienne avec une petite
quantité de l’encre de chine (1 ou 2 gouttes) ;
2. Avec une autre lame étendre la goutte jusqu’à l’obtention d’une couche mince ;
3. Sécher la lame ;
4. Rincer doucement avec l’eau distillée ;
5. Couvrir la lame avec le cristal violer pendant 1 minute ;
6. Rincer avec l’eau ;
7. Colorer avec la safranine pendant 30 secondes ;
8. Sécher ;
9. S’il ya une capsule, la bactérie apparaître avec une coloration rouge rose entourée d’une zone
claire.

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II.2.4.3- Autres méthodes :

 On utiliser simplement le cristal violet avec l’encre de chine comme suite :

1. Sur une lame propre mélanger quelques gouttes de la suspension bactérienne avec une petite
quantité de l’encre de chine;
2. Avec une autre lame étendre la goutte jusqu’à l’obtention d’une couche mince ;
3. Fixer doucement avec la chaleur ;
4. Le frottis est coloré avec le cristal violet ;
5. Rincer à l’eau distillée ;
6. Sécher puis observer à immersion.
 Ou on utilise seulement l’encre de chine pour observer la capsule comme suite :
1. Sur une lame mettez une goutte de la suspension bactrienne ;
2. A côté de cette dernière mettez une goutte de l’encre de chine ;
3. Mélanger les goutes ;
4. Observer au microscope jusqu’à l’obtention des cellules entourées d’un halo claire.

II.2.5- Coloration des flagelles : (Flagella Staining : West method)

II.2.5.1- Principe :
Flagelles bactériens sont des fines organites filiformes, de la locomotion. Ils sont minces (environ 10 à
30 nm de diamètre) et peut être vu directement en utilisant uniquement le microscope électronique.
Afin de les observer avec un microscope optique, l'épaisseur des flagelles est augmenté par l’utilisation
(revêtement) des mordants tels que l'acide tannique et alun de potassium (tannic acid and
potassium alum), et les colorer avec la fuchsine basique (Méthode de Gray), pararosaniline
(méthode de Leifson), nitrates d'argent (méthode de West; nommé d'après Marcia West,
microbiologiste clinique), ou cristal violet (Difco’s method). Bien que les procédures coloration des
flagelles soient difficiles à réaliser, ils fournissent souvent des informations sur la présence et
l'emplacement de flagelles, ce qui est d'une grande valeur dans l'identification bactérienne (figure 11).

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Figure 11: Arrangement of Flagella on Bacterial

Cells.
(a) In monotrichous, polar, a single flagellum is
located at one end of the cell; (b) in lophotrichous,
polar, many flagella are grouped at one end of the
cell; (c) in amphitrichous, polar, a single flagellum is
located at both ends of the cell; and (d) in
peritrichous, flagella are located all around the cell.

II.2.5.2- Protocole de la coloration :

1- Préparer un frottis bactérien aseptiquement et laisser la lame sécher à l’air, pendant 15
minutes ;
2- Couvrir le frottis sec avec la solution A (le mordant) pendant 4 minutes ;
3- Rincez abondamment à l'eau distillée ;
4- Placez un morceau de papier ensuit sur le frottis et tremper avec une solution B (le colorant).
Chauffer la lame dans un bain d'eau bouillante pendant 5 minutes. Ajouter plus de colorant de
garder la diapositive de sécher ;
5- Retirez la serviette puis rincer l'excès de solution B avec de l'eau distillée. Rincer la lame avec
l'eau distillée et laisser reposer pendant 1 minute tandis que plus de résidus de nitrate d'argent
flotte à la de surface.
6- Ensuite, rincer délicatement à l'eau une fois de plus et de agiter prudemment pour éliminer
l'excès d'eau de la lame ;
7- Laisser la lame sécher à l'air et à température ambiante ;
8- Examinez la lame avec l'immersion.

Figure 11: West Silver-plating Staining.

Examples of several patterns of flagellation as seen with the light microscope.
(a) Alcaligenes faecalis with peritrichous flagella, West silver-plating
staining. (b) Pseudomonas fluorescens with polar monotrichous
flagella, West silver-plating staining (×1,000).

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Figure 11: Flagella Staining Procedure (West).

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