République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Constantine 3
École nationale polytechnique de Constantine

TP MICROBIOLOGIE
L’étude des effets des milieux de culture
sur la croissance bactérienne

BELHANI Med Afif

BEGGOUR Safa

BALI Aymane

BENMESSAOUD Nadjiba

BENHAMED Mourad
I- But du TP :

L’Etude des différents milieux de culture, et voir leurs effets sur la croissance bactériennes.

II- Principe du TP :

Ensemencement d’un échantillon d’eau et l’incuber à une température 37°C durant 24H,48H, 72H. ce
sont les durées maximales de vie d’une bactérie dans le corps humain. Et à la fin le calcul du nombre
des colonies formées par millilitre d’échantillon.
Alors on va étudier 3 types de milieux de culture solides :
- Milieux complexes (GNO)
- Milieux sélectifs (Chapman, Mac Conkey)
- Milieux d’isolement et d’identification (Chapman, Mac Conkey)

III- Expériences :
a) Matériels / Produits : Tubes à essai
- Etuve thermostatée à 37°C
- Boites de pétrie
- Pipettes
- Bain d’eau thermostaté Boites de pétrie

- Tubes à essai
- Bec benzène
- Gélose nutritive Ordinaire

1- Partie 1 : Dénombrement des germes totaux sur gélose nutritive ordinaire (GO)

On s’intéresse dans cette partie au dénombrement des bactéries présentes dans l’eau. Ces germes
sont des germes aérobies mésophiles :
Germes : microbes = bactéries +levures + moisissures
Aérobies : se développent en présence d'air
Mésophiles : à température moyenne 25-30°C
Ils se développent sur un milieu nutritif ordinaire non sélectif (GNO)

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 a) Milieu de culture :
La gélose nutritive ordinaire GNO :
 Composition :
• Extrait de viande : 1,0g/L
• Extrait de levure : 2,5g/L
• Peptone 1 : 5,0g/L
• Chlorure de sodium NaCl : 5,0 g/L
• L'agar-agar 2 : 15,0 g/L
• pH : 7,0

On a choisi la gélose nutritive pour permettre aux bactéries de se nourrir et de se développer pour
former des colonies visibles qu’on va les compter après. Et vu qu’on veut une étude non sélective
on utilise La GNO.

b) Ensemencement :
L’ensemencement utilisé est un ensemencement en surface « spread
plates » (par inondation) il s’agit d’étaler l’échantillon sur la gélose
nutritive.
Il existe plusieurs autres types d’ensemencement tel que :
Ensemencement dans la masse
- Ensemencement dans la masse.
- Ensemencement par stries transversales pour dissémination.
- Ensemencement par stries épaisses.
- Ensemencement par inondation.
- Ensemencement par piqûre et par touche.
Ensemencement par stries
transversales pour
dissémination

c) Observation :
Vu qu’on n’a pas allez observer et compter le nombre de colonies de notre incubation on va utiliser
les données trouver par le SG2 qui ont observé leur milieux de cultures après 48H.
Donc ils ont observé la formation de colonies de bactéries sur la gélose nutritive ordinaire, qui ont
formées des cercles jaunes.

1 Les peptones (anciennement albuminoses) sont les produits d'une réaction d'hydrolyse de produits alimentaires riches en protéines.
2
L'agar-agar est un polymère de galactose (galactane) contenu dans la paroi cellulaire de certaines espèces d'algues rouges appartenant aux
familles des Gelidiacées (Gelidium et Pterocladia) et des Gracilariacées (Gracilaria).
2 | Page
d) Calcul de la concentration des germes totaux :

On va calculer la concentration des colonies par unité de volume :

1 ∶
∗
= 1⁄ = ∶
= ′é ℎ "é
 Eau du robinet :
Ils ont utilisé les échantillons de facteur 10$% et la solution Mère

≥ 219 ⟹ = = 2,19.10= ⁄
/012.3454 89:
&.()*) 67 ;.9
@
/01@A>? 99∗ >?
9;>? = 11 ⟹ = @A
= 11.10% ⁄
67 9

 Eau Contaminée :
Ils ont utilisé les échantillons de facteur 10$% et la solution Mère

≥ 295 ⟹ = = 2,95.10= ⁄
/012.3454 8:C
&.()*) 67 ;.9
@
/01@A>? =F∗ >?
9;>? = 37 ⟹ = @A
= 37.10% ⁄
67 9

• On remarque qu’il y a bien beaucoup de bactéries dans l’eau contaminée comparant à l’eau du
robinet.
• On voit qu’il y a beaucoup de colonies dans l’échantillon de la solution mère qui rend le
dénombrement très difficile et qui va fausser les calculer, Donc on va utiliser les résultats des
échantillons dilués.

e) Conclusion :

Cette méthode de dénombrement nous a permis de savoir la quantité de bactéries qui se trouve dans
l’eau, et la comparer avec les normes pour permettre à dire que cette eau est contaminée ou non.

2- Partie 2 : Culture des staphylocoques sur le milieu Chapman :

On s’intéresse dans ce TP au dénombrement des Staphylocoques présentes dans l’eau. Ces germes
sont des germes de type cocci à Gram positif aérobie-anaérobie facultatives. et se développe bien sur
les milieux minimum. C'est une bactérie mésophile, neutrophile et halophile (se développe à de fortes
concentrations de NaCl).
Les staphylocoques poussent aisément sur les milieux usuels, donnant des colonies rondes, lisses,
blanches (S. blancs ou S. Albus) ou dorées (S. dorés ou S. Aureus).

3 | Page
a) Milieu de culture :

Le milieu Chapman

 Composition :
• Peptone : 10,0 g/L
• Extrait de viande : 1,0 g/L
• Mannitol : 10,0 g/L
• Chlorure de Sodium NaCl : 75,0 g/L
• Rouge de Phénol : 25,0 g/L
• Agar-Agar bactériologique : 15g/L
• pH : 7,4 ± 0,2

On a choisi le milieu Chapman car il est sélectif et différentiel.

- Sélectif : car il a une grande concentration en NaCl, et vu qu’on est en train de cultiver la
Staphylocoque qui est de nature halophile ; on aura dans notre culture que des Staphylocoques.
- Différentiel : à cause du Mannitol qui entre dans la composition du milieu Chapman, permet de
distinguer entre une colonie des S. Aureus (fermante le Mannitol ; CREATION D’ACIDE ‘couleur
jaune’) et des S. Albus (ne fermente pas le Mannitol ; PAS DE CREATION D’ACIDE ‘couleur rouge’).

b) Observation :

Les observations sont faites après 48h de l’incubation

• On remarque qu’il existe deux types de colonies (dorées opaques) et incolores.
• On constate que les tailles des colonies de la solution mère contaminé sont assez importantes.
• Une couleur jaunâtre autour des colonie opaques.

c) Explication :
- Les deux types de colonies réfèrent aux S. Aureus (dorées opaques) et S. Albus (incolores).
- La grande taille des colonies est due aux grands nombres de bactéries présentes dans la solution
contaminées mère, d’ailleurs sa compense le nombre qui n’est pas très grand.
- C’est les S. Aureus qui fermente le mannitol et créent de l’acide, donc le rouge du phénol devient
jaune en solution acide.

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f) Calcul de la concentration des germes totaux :

On va calculer la concentration des colonies par unité de volume :

1 ∶
∗
= 1⁄ = ∶
= ′é ℎ "é
 Eau du robinet :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$= et la solution Mère

= 31 ⟹ = ;.9 = 3,1.108 ⁄
/012.3454 =9
&.()*) 67
@
/01@A>H 99∗ >H
9;>H = 11 ⟹ = @A
= 11.10= ⁄
67 9

 Eau Contaminée :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$% et la solution Mère

= 22 ⟹ = = 2,2.108 ⁄
/012.3454 88
&.()*) 67 ;.9
@
/01@A>? 8;∗ >?
9;>? = 20 ⟹ = @A
= 20.10% ⁄
67 9

• L’échantillon de la solution mère contaminée contient des colonies trop grandes donc ça va fausser
le calcul
• On remarque que la concentration en colonie de la solution contaminé est bien grande que celle
du robinet

Maintenant on va calculer les concentrations en fonction de chaque type de Staphylocoques :

 S. Aureus :
 Eau du robinet :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$= et la solution Mère

= 15 ⟹ = ;.9 = 1,5.108 ⁄
/012.3454 9C
&.()*) 67
@
/01@A>H 9∗ >H
9;>H =1 ⟹ = @A
= 10= ⁄
67 9

 Eau Contaminée :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$% et la solution Mère

= 11 ⟹ = ;.9 = 1,1.108 ⁄
/012.3454 99
&.()*) 67
@
/01@A>? 9J∗ >?
9;>? = 18 ⟹ = @A
= 18.10% ⁄
67 9

5 | Page
  S. Albus :
 Eau du robinet :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$= et la solution Mère

=1 ⟹ = = 10 ⁄
/012.3454 9
&.()*) 67 ;.9
@
/01@A>H 9;∗ >H
9;>H = 10 ⟹ = @A
= 10.10= ⁄
67 9

 Eau Contaminée :
On a utilisé les échantillons de facteur 10$% et la solution Mère

= 11 ⟹ = = 1,1.108 ⁄
/012.3454 99
&.()*) 67 ;.9
@
/01@A>? 8∗ >?
9;>? =2 ⟹ = @A
= 2.10% ⁄
67 9

3. Partie 3 : Culture des Entérobactéries (E. Coli) sur le milieu Mac Conkey :
Dans ce TP on s’intéresse au dénombrement des entérobactéries présentes dans toutes les eaux
et en particulier les eaux destinées à l’alimentation. Ces bactéries sont des bacilles à Gram négatif,
aérobies facultatives.
Bacilles à gram négatif : Le principal exemple est Escherichia coli.
Aérobies facultatifs : Ne se développent pas en présence d'oxygène, mais dans certaines
conditions, sont capables de vivre dans un milieu oxygéné.
Milieu Mac Conkey : Milieu sélectif pour l’isolement des bactéries à Gram négatif
(entérobactéries)

a) Milieu de culture :

Gélose Mac Conkey

 Composition :
• Peptone de caséine : 17.0 g
• Peptone de viande : 3.0 g
• Sel biliaires : 01.5 g
• Cristal violet : 0.001 g
• Chlorure de sodium : 5.0 g
• Rouge neutre : 0.003 g
• Agar- agar bactériologique : 13.5 g
• Ph du milieu prés à l’emploi : 7.1 ± 0.2

On a choisi le milieu Mac Conkey car il est un milieu sélectif pour les entérobactéries (E. Coli)
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b) Observations :
Les observations sont faites après 48 h de l’incubation, on a remarqué les résultats suivants :
• Dans les échantillons de l’eau de robinet on n’observe aucune formation des colonies dans
la solution mère et la solution dilué.

Solution mère de l’eau de robinet Solution dilué KL$M de l’eau de robinet

• Dans les échantillons de l’eau épurée on n’observe aucune formation des colonies dans la
solution diluée malgré son nombre important dans la solution mère
Solution mère de l’eau épurée Solution dilué KL$N de l’eau de épurée

Il y’a une erreur dans les résultats ; les colonies ne

se présentent que dans l’échantillon de la solution
mère de l’eau épurée

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Réponse aux questions :

1- On a utilisé ce milieu car :

• Il favorise le développement de tous les organismes de la famille des Entérobactéries
ainsi que de nombreux autres bâtonnets Gram-négatifs.
• Les non-fermentants ou les autres bâtonnets Gram-négatifs sensibles à ses
composants sélectifs ne se développent pas dans ce milieu.
• Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+ :
- les sels biliaires
- le cristal violet
• Ce milieu inhibe l’essaimage des espèces de Proteus, pour obtenir une différenciation
plus nette des fermentants et non-fermentants du lactose et pour stimuler la
croissance des bactéries entériques.

2-Explication des résultats :

• Des colonies incolores avec un virage de couleur du milieu vers le jaune, dans la solution
mère de l’eau épurée. Çà indique que les bactéries n’ont pas fermenté le lactose (lactose
négatif) – le « rouge neutre » prend la couleur rouge dans un milieu acide –.

IV- Conclusion :

On voie que les la croissance bactérienne dépend du milieu de culture, et ce dernier peut limiter la
croissance d’un type de bactéries par apport un autre, s’il contient des inhibiteurs.

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