1.

Site et présentation du lieu de l’étude

Notre étude sera réalisée au laboratoire de bacteriologie de l’Hôpital General de Yaoundé sur
une période de 3 mois allant de juillet- septembre 2021.

2. Justification du cadre de l’étude

Le choix d’effectuer notre étude dans cet hôpital est due au fait que :
On aura une grande taille d’echantillon
HCY est une grande structure hospitalière qui acceuille beaucoup de patient donc on aura la
chance de pouvoir isoler nos souches d’E.coli.
3. Type d’étude
Nous allons effectuer une étude descriptive, transversale et prospective.
4. Durée de l’étude
L’étude s’étendra sur une période de 4 mois allant de juillet 2021 à octobre 2021
5. Population d’étude
La population d’étude sera celle venue en consultation à l’hôpital général de Yaoundé
 Population cible
La population cible serait constituée des patients interne et externe à qui on aura prescrit
un examen bactériologique

6. Taille de l’échantillon
Des études ont été récemment menées par Ebongue et al (2014) au Cameroun a l’hôpital
général de Douala et ont révélées une prévalence de 34,47% de l’infection à E. coli. Cette
prévalence connue nous a permis d’avoir une estimation de la taille de notre échantillon à
partir de la formule de Lorentz suivante :
2
Z. x . p.q
N= 2
i
N : taille de l’échantillon
P : prévalence d’E. coli isolée des prélèvements urinaires
Q : 1-p événement contraire
Z.x : valeur de distribution normal qui correspond à un seuil de précision 95% (Z.x =1.96)
I : erreur de précision = 5%
 AN : N= (1.96)2×0.3447× (1-0.3447) / (0.05)2=347.09
Ainsi, la taille de notre échantillon sera fixée à un minimum de 347 souches d’E. coli isolé

7. Echantillonnage
L’échantillonnage sera de type non probabiliste de convenance
 Variables dépendantes
- Fréquence des souches de E. Coli isolées
- Profil de résistance aux carbapénèmes des souches de E. coli
- Phénotype des mécanismes de résistance d’Escherichia Coli

 Variables independents
- Caractéristiques sociodémographiques (âge, sexe)
- Statut du patient (interne ou externe)
- Service de provenance
- Nature du produit pathologique

a. Critère d’échantillonnage
i. Critère d’inclusion
Nous incluons dans notre étude tous les participants internes et externes venus effectuer un
examen bactériologique et qui aurons signé un examen un formulaire.
ii. Critère d’exclusion
Nous exclurons de notre tous les patients internes et externes venues un effectuer un examen
bactériologique et qui n’aurons signé un formulaire.

8. Matériel et méthode de recherche

8.1. Outils et matériels
a. Matériel biologique
 Une souche de référence de E. COLI ATCC 25922 pour contrôle
 Les souches de E. Coli isolée
b. Matériel de transport et conservation

 Transport: Portoirs, Cryotubes; glaciere

 Conservation : Bouillon cœur-cervelle, congélateur
c. Matériel pour la collecte et l’identification

Nous aurons besoins de :

 Écouvillons stériles,
 Eau distillée,
 Tube à hémolyse,
 Boites de pétri,
 Vortex,
 Étuve,
 Bec-bunsen,
 Les colorants pour coloration de Gram,
 Microscopes,
 Milieux de culture avec et sans gel d’agarose (EMB, Muller-Hinton),
 Boîtes de pétri, mini galerie d’identification des bacilles Gram négatif (Api 20NE)
 Oxydase
 Catalase
 Galerie API 20E
 Tube à hémolyse stérile, pipette pasteur, anse de platine

d. Matériel pour la préparation des milieux de cultures

 Bec-bunsen,
 Autoclave, Poupinel,
 Balance de précision,
 Milieux avec et sans gel d’agarose (EMB, Muller-Hinton),
 Ballon à fond plat, burette graduée,
 Boite de pétri

e. Matériels pour l’antibiogramme

  Eau distillée,
 Souches bactériennes de E. coli,
 Micropipettes,
 Disque d’antibiotique
 Antibiotique lyophilisé d’Imipénème, Méropénème,
 Bouillon Muller-Hinton, pipette stérile,
 Antibiotiques carbapénèmes, embouts, tubes à hémolyses stériles
 Etuve

f. Matériel didactique
 Clairance éthique
 Autorisation de collecte ;
 Fiche de consentement volontaire et éclairée
 Fiche de renseignement sur l’étude ;
 Cahier de recherche
 Registre des patients volontaire à l’étude
 Feuille de paillasse des patients ;
 Clairance éthique ;
 Fiche de questionnaire

9. Procédure de collecte et analyse des échantillons

9.1. Transport des échantillons

Après collecte des échantillons, sont acheminés directement au laboratoire dans des portoirs
appropriés pour analyse
10.Analyse des échantillons aux laboratoire
10.1.Méthode
 Recrutement des souches
L’isolement des souches de E. Coli se fera d’une part au laboratoire de l’Hôpital Central
de Douala après analyse microbiologique des différents prélèvements collectés. Par
ailleurs, une fiche de collecte comportant l’identification du patient, la nature de
prélèvement, le service de provenance, le germe isolé et les résultats de l’antibiogramme
sera établie
  Culture
La préparation des milieux de culture (Drigalski, , Muller Hinton, EMB, Bouillon MH
et Bouillon Cœur-Cervelle) sera faite selon les recommandations du CASFM/EUCAST 2021
(confère annexe 5, 6, 7).

 Contrôle qualité des milieux de culture et disques d’antibiotiques

Les milieux préparés subiront les tests suivants :
- Test de fertilité : il consistera à vérifier la bonne croissance d’une souche de E. Coli
(CASFM/EUCAST, 2021) connue conservée dans le milieu Drigalski ; nous l’incuberons
pendant 18 à 24h à 37°C et apprécierons les caractères morphologiques (aspect, taille) en
comparant à la description standard du germe.
- Test de stérilité : il consistera à incuber dans l’étuve les différents milieux préparés
pendant 18 à 24h à 37°C ; et les milieux seront dits stériles s’il y aura absence de croissance
bactérienne (colonies ou turbidité). Ces milieux de culture seront conservés au réfrigérateur à
4°C pendant 20 jours au maximum selon le protocole de qualité de l’institution
(CASFM/EUCAST, 20121).
- Contrôle qualité des disques d’antibiotiques : il consistera à vérifier que les valeurs
des CMI seront bien dans les limites requises pour chaque association antibiotique-bactérie
(CASFM/EUCAST, 2021).
 Ensemencement
Après prélèvement, les échantillons sont directement transportés en salle d’analyse pour
mise en culture. La culture se fais par ensemencement sur le milieu de culture EMB
(milieu de culture qui ont subi les différents tests de stérilité, test de fertilité et test de
spécificité). Par la technique des stries à l’aide d’une anse. La boite de pétri étiqueté du
code patient et ensemencée de notre échantillon est ensuit placée à l’incubateur à 37°C
entre 18 et 24h
Figure 1: méthode d'ensemencement par des stries(Cavallo et al., 2006)

 Examen microscopique
10.2.Identification des souches de E. coli
Après 24h d’incubation, on observe sur le milieu EMB des colonies pures lactose positif, des
colonies rondes, lisses à bords réguliers de 2 à 3 mm de diamètre avec un reflet métallique.
On peut aussi procéder à un repiquage des colonies pour avoir des colonies bien isole et un
Gram de contrôle tout ceci de nature à rendre facile et évident l’identification mais également
procéder par l’identification biochimique des souches de E. coli (mini galerie API, Galerie
API20E).
 Identification microscopique (coloration de Gram)
Principe
Cette coloration est largement utilisée, elle permet d’étudier les affinités tinctoriales des
germes. Elle donne aussi des renseignements sur la prédominance des espèces présentes
(espèce pure ou une flore complexe). Le résultat permet de distinguer les bactéries à
Grampositif de celles à Gram négatif. (Leulmi, 2015)
Protocol
Etape 1 : Préparation des frottis
 A l’aide d’une pipette stérile on prélève une colonie de E. Coli. Celle-ci est déposée sur
une lame propre qui contient une goutte d’eau physiologique avec étalement en fine
conche. On termine par fixer la préparation à la chaleur.
Etape 2 : La coloration
- Après séchage de la lame, le frottis est recouvert avec le violet de gentiane pendant
1minute.
L’excès de colorant est éliminé. De même pour le lugol. On le laisse au contact de la
lame pendant 1 minute ;
- La lame est décolorée dans de l’alcool pendant 1à 2 secondes. Cette durée est variable
selon l’épaisseur du frottis, puis rincée à l’eau immédiatement ;
- Recouvrir la lame par la fushine diluée pendant 30 secondes à 1 minute ;
- La lame est enfin lavée puis séchée entre 2 feuilles de papier filtre. Son examination se
fait sous microscope optique Gr10X100). Les bactéries à Gram positif sont colorées le
cytoplasme en violet et les bactéries à Gram négatif sont colorées en rose.

 Identification biochimique

 Test d’orientation
- Test de catalase

Principe
C’est un test de base dans l’identification des bactéries à Gram positif. La catalase est une
Enzyme qui est produite en abondante par les bactéries à métabolisme respiratoire qui
peuvent détruire les peroxydes H2O2 ce qui a un effet létal pour la bactérie. Ce test
repose sur la décomposition de peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène selon
la réaction suivante :
H₂O₂ H₂O + ½ O₂
Technique
- Sur une lame propre sèche, déposer quelques gouttes d’eau oxygénée à 10 volumes,
- Ajouter l’inoculum bactérien à l’aide d’une anse de platine ou pipette de pasteur boutonnée
- Observer immédiatement à l’œil nu (figure18)
- Catalase positive : se traduit par l’apparition des bulles d’air, dégagement gazeux de
Dioxygène
- Catalase négative : absences des bulles d’air ou d’effervescence
- E. Coli est catalase positive

Figure 2: Test de catalase(Beyrouthy, 2014)

 Test d’oxydase
Principe
Ce test permet la mise en évidence de la production de la bactérie étudié de l’enzyme «
Oxydase ». Les bactéries possédant une chaîne respiratoire complète sont dotées d’une
Enzyme cytochrome oxydase. L’oxydation de Tétraméthyl-p-phénylènediamine indique la
présence d’une oxydase chez la bactérie oxydase. (El Bouamri, 2017)

Technique
- Sur une lame de verre propre, déposer un disque imprégné de solution d’oxydase fixée
par
L’eau distillée à l’aide d’une pipette pasteur stérile flambée, on dépose la colonie à étudier et
- Observer immédiatement.
- Oxydase positive : coloration violette
- Oxydase négative : pas de coloration
- E. Coli est oxydase négative
Figure 3: test d'oxydase(Working Group “Guidelines and Evidence-Based Laboratory
Medicine” of the Société Française de Biologie Clinique (SFBC) et al., 2012)

 Identification par la galerie API 20 E

Principe
Après isolement sur milieu gélosé EMB, l’identification des différentes espèces de bactéries
se fera à l’aide de la Galerie API 20E (bio Mérieux). Le système API® Bio Mérieux
(Appareillage et Procédé d’Identification) est une version miniaturisée et standardisée des
techniques biochimiques conventionnelles pour l’identification des bactéries. Elle permet
l’identification d’une centaine des bacilles à gram négatif dont E. coli. Elle comprend 20 tests
biochimiques.
. Les tests conventionnels ont été inoculés avec une suspension bactérienne préparée à une
turbidité bactérienne d’opacité égale à 0,5 de McFarland. Les réactions qui se produisent
pendant la période d’incubation (18-24h) se traduisaient par des virages colorés spontanés ou
révélés par l’addition de réactifs. Les tests d’assimilation seront inoculés avec un milieu
minimum et les bactéries seront cultivées si seulement elles sont capables d’utiliser le
substrat correspondant. La lecture de ces réactions est faite à l’aide du tableau de lecture et
l’identification obtenue à l’aide d’un catalogue analytique.
Protocol
- Préparation de la galerie
Prendre le couvercle de la galerie qui contient des alvéoles. A l’aide d’une seringue stérile on
ajoute 5 ml d’eau distillé dans le but de créer une atmosphère humide.
- Préparation de l’inoculum
Prélever quelques colonies bien isolées de la souche à tester puis réaliser une suspension
Bactérienne dans de l’eau distillée en s’assurant de l’homogénéisation des bactéries dans le
milieu.
- L’ensemencement
Après préparation de l’inoculum à l’aide d’une pipette pasteur ou seringue on remplit les
Cupules avec la suspension bactérienne. Pour les tests CIT (Citrate) VP (VogesPskaur) et
CEL (Gélatinase), on va remplir les tubes et Les cupules. Par contre pour les autres tests, on
remplit uniquement les tubes et non les cupules avec création d’anaérobiose dans les tests
ADH (Arginine dihydrolase), LDC (Lysinedécarboxylase), H2S (production d’H2S), URE
(Uréase), ODC (Ornitine décarboxylase) enremplissant leurs cupules par l’huile de vaseline.
- Incuber à 37°C pendant 18-24 heures
- La lecture de la galerie API20E se fait à l’aide du tableau de lecture et l’identification qui
est obtenue à l’aide du catalogue analytique ou d’un logiciel d’identification
Les caractéristiques biochimiques de E. coli sont :
 Indole positif ;
 Lactose positif
 Mobile par une ciliature péritriche ;
 Se développe en Aero anaérobiose et sur gélose nutritive ordinaire ;
 Acidifie le glucose par voie fermentative avec production de gaz ;
 Oxidase negative;
 Réduit les nitrates en nitrites ;
 ONPG +;
 Mannitol +;
 Urease negative;
 Ne produit pas le sulfure d’hydrogène ;
 Incapable d’assimiler le citrate comme seule source de carbone en aérobiose

 Mini galerie Api 20E

 Recherche de la production de lactose, glucose, H2S et de Gaz :

Elle se faisait à l’aide du milieu Kligler-Hajna. Ces milieux sont coulés en pente et
permettent la recherche simultanée de ces quatre paramètres. La technique particulière
d’ensemencement de ces milieux permettait de distinguer les phénomènes selon leur lieu,
pente ou culot ; à partir d’une suspension bactérienne, la pente est ensemencée par des
stries serrées et le culot par piqûre centrale. Après 24heures d’incubation, les
changements colorimétriques sont observés puis interprétés : lorsque le culot est jaune, la
 bactérie est dite glucose positif. Si la couleur du culot reste inchangée, alors la bactérie
est dite glucose négatif. Au niveau de la pente, si elle est jaune, la bactérie est dite lactose
positif. S’il n’y a pas de changement de couleur, la bactérie est dite lactose négatif.
Lorsqu’on observe un précipité noir, la bactérie est dite H 2S positif. Lorsqu’il y’a le
décollement de la gélose et ou la présence des bulles dans la gélose, on concluait qu’il y’a
production de gaz par la bactérie. Ainsi pour E. coli est mis en évidence par : Glucose+,
lactose+, H2S- et Gaz+.

Figure 4: E.coli sur Api 20 E (Working Group “Guidelines and Evidence-Based Laboratory
Medicine” of the Société Française de Biologie Clinique (SFBC) et al., 2012)

 Recherche de la production de l’Urée et de l’Indole

Elle se fait à l’aide du milieu urée-indole de Ferguson selon la procédure décrite par
Guillaume (2004) : une colonie provenant de la culture sur gélose nutritive est introduite
dans 0,5 ml du dit milieu puis mélangée. Après incubation pendant 24 heures, la présence
d’une uréase fait virer le milieu du jaune orangé au rouge.
Ensuite on y ajoutait quelques gouttes du réactif de Kovacs, après agitation, la production
d’indole est révélée par la présence d’un anneau rouge en surface. L’identification de E. coli
est mis en évidence par : Urée-, Indole+

 Recherche de la production du Mannitol-mobilité :

Le milieu Mannitol-Mobilité est également utilisé pour l’identification d’E. coli A l’aide de
l’anse contenant une suspension bactérienne, on effectue une piqure centrale dans la gélose.
Après 24 heures d’incubation à 37°C, si le milieu vire au jaune, on dit que la bactérie est
mannitol positif, si le milieu reste inchangé, la bactérie est dite mannitol négatif. Dans le cas
où on n’a une gélose trouble et diffuse, la mobilité est positive. Dans le cas d’E. coli, on
recherche mannitol+ et mobilité+.
.
 Recherche de la production de citrate de Simmons (CS))

Le milieu citrate de Simmons est utilisé pour caractériser de manière biochimique E. coli. A
l’aide de l’anse contenant une suspension bactérienne, on effectue une piqure centrale dans
la gélose. Ensuite on fait des stries serrées sur cette dernière en ressortant l’anse. Après 24
heures d’incubation, si on observe un virage de couleur vers le bleu, alors la bactérie est
CS+. S’il n’y a pas de virage, alors elle est CS- L’identification d’E. coli s’observe avec
CS-.

11.Recherche des différents phénotypes des mécanismes de résistance de

E. coli

11.1.Choix et disposition des disques d’ATB

Le choix des antibiotiques est base sur la connaissance du phénotype naturel des souches
de E. Coli c’est-à-dire sur la sensibilité et la résistance naturelle de ce germe vis-à-vis des
différentes familles antibiotiques connues. Ainsi les antibiotiques testés lors de la
réalisation de l’antibiogramme sont
 Carbapénème : imipenème
 Cephalosporine:cefalotine,cefuroxime,cefotaxime.cefixime,ceftazimide et
céfépime, cefoxitine
 Aminopenicilline : amoxicilline
 Carboxypenicilline : ticarciline
 Ureidopenicilline : piperaciline
 Tazobactame : piperaciline/ tazobactam
 Oxapename: ticarcilline/acide clavulanique, amoxilline/acide clavulanique
 Monobactam: aztreonam
  Aminoside : gentamicine,tobramycine,netilmicine,amikacine
 Quinolones : ciprofloxacine, ofloxacine, levofloxacine,norfloxacine, acide
nalidixique

Les 24 disques d’antibiotique seront dépose dans deux boites de pétri notamment la boite pétri
carre de 120 mm ou 16 antibiotiques seront déposés et la boite de pétri ronde de de 90mm ou
8 antibiotiques seront déposés. Les disques choisis seront poses à l’aide de la pince flambée
en appuyant légèrement en respectant une distance de 15mm minimum des bords de la boite
et 30mm maximum entre les disques figure

Figure 5: disposition des antibiotiques (CASFMV2021)

 Méthode
 Le Milieu Muller Hinton qui est utilisé pour l’antibiogramme doit être coulé dans des
boites de pétri sur une épaisseur de 4 mm Les géloses doivent être séchées avant l’emploi.
 A partir d’une culture pure de 18 à 24 heures sur milieu d’isolement approprié, racler
l’aide d’une anse en platine quelques colonies bactériennes.
 Décharger l’anse dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile à 0.9%, bien homogénéiser la
suspension bactérienne. Sa capacité doit être équivalente à 0,5 MF(Macfarland)
 Tremper un écouvillon stérile dans l’inoculum puis l’essorer en le tournant contre la paroi
interne du tube afin de décharger au maximum.
 Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosé (milieu Muller Hinton), séché de
haut en bas, en stries serrés. Répéter l’opération 2 fois, en tournant la boite de 60° à
 chaque fois, sans oublier de faire pivoter l’écouvillon sur lui-même. Finir
l’ensemencement en passant l’écouvillon sur le périphérique de la gélose
 Déposer les disques d’antibiotiques sur la boite de pétrie (Il est préférable de ne pas mettre
plus de 6 disques sur une boite de 90 mm).
 Presser chaque disque d’ATB à l’aide de pince bactériologique stérile et ne pas déplacer
les disques après leur application. Puis incuber les boites à 35°C pendant 24-48 heures.
 Après cette incubation, mesurer avec précision les diamètres des zones d’inhibition. Pour
les bactéries testées sur Muller-Hinton simple, les mesures seront prises en procédant par
transparence à travers le fond de la boite de pétri fermée.
 Pour les bactéries testées sur Muller- Hinton au sang, les mesures des diamètres de zones
d’inhibition seront prises avec des boites de pétri ouvertes et bien éclairées.
 Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques dans la table de lecture
correspondantes. Les bactéries sont classes dans l’une des 3 catégories suivantes :
S/Sensible, R/Résistante, I/Intermédiaire. (CS SFM2021)
La détection des bêtalactamases à spectre élargi peut être facilitée sur l’antibiogramme
par diffusion par rapprochement des disques d’acide clavulanique, de Ceftazidime,
d’Aztréonam ou du Céfépime.

 Caractérisation phenotype des souches

La croissance bactérienne s’arrête lorsqu’elle rencontre une concentration égale à sa

CMI et la mesure du diamètre reflète donc la valeur de cette CMI. Ces valeurs sont
interprétées en fonction des abaques de lecture conformément aux normes du CA-SFM
(2021). Cela a permis de classer une souche bactérienne en :

- Sensible (S) : souche pour laquelle la CMI de l’ATB testé est inférieure ou
égale à la concentration critique basse, ce qui correspond à un diamètre supérieur ou égal au
diamètre critique D ;
- Intermédiaire (I) : souche dont la CMI de l’ATB testé et le diamètre
correspondant sont compris entre deux concentrations critiques et deux diamètres critiques ;
- Résistant (R) : souche dont la CMI de l’ATB testé est supérieure à la
concentration critique haute C, correspondant au diamètre inférieur au diamètre critique d
(tableau x)

Tableau IV. Critères de catégorisation selon les valeurs critiques (CA-SFM, 2021).
 Categories CMI (mg/L) Diamètre (Ɵ) (mm)
S CMI ≤ c Ɵ≥D
I c < CMI ≤ C d≤ Ɵ<D
R CMI < C Ɵ<d

Le profil de résistance aux ATBs obtenu permettra d’établir les différents phénotypes
observés chez E. coli :

11.2. Phénotype sauvage

Les souches sauvages de E. Coli sont naturellement sensibles aux antibiotiques testes. Ainsi
nous devons obtenir des diamètres d’inhibition supérieurs ou égal à ceux proposés par CA-
SFM 2021

11.3. Phénotype de résistance

Les souches sauvages de E. Coli acquièrent un phénotype de résistance suite à des
mécanisme enzymatique ou non enzymatique. Ainsi les diamètres d’inhibition obtenus seront
variables (S,R,ou I) et interprète a fin de ressortir le phénotype observe sur la souche étudié

a. Les phénotypes de résistance acquise de E. Coli aux bêtalactamines :

Tableau 1: caractéristiques des phénotypes de résistance acquise aux beta lactamine chez E.
Coli

Antibiotiques Phénotypes

PBN PHN TRI BLSE CBN CHN Carbénmase

Amoxicilline R R R R R R R

Amoxicilline + S S R V R R R
ACLAV

Ticacilinne R R R R S R R

Ticacilinne+ S I/R R V S R R
ACLAV

Piperacilline S I/R R R S R I/S

 Piperacilline + I I/R R V S I/R I/S
Tasobactame

Ibipénème S S S S S S I/R

Cephalotine S I/R S R R R R

Cefurozine I/S S/R S R S R R

Astrioname S S S R S I/R I/S

Cefisime S S S R S R R

Ceftazidime S S S R R I/R R

Cefotaxime S S S R S R R

Cefepime I/S S S R S S/R R

Cefositime S S S S S/R R V

Pénicillinase a bas niveau (PBN)

Pénicillinase a haut niveau (PHN)
Beta lactamase résistant aux inhibiteur (TRI)
Beta lactamase a spectre elargie (BLSE)
Cephalosporinase bas Niveau (CBN)

Cephalosporinase Haut Niveau (CHN)

Carbapenemase

i. Les phénotypes de résistance acquise de E. Coli aux aminosides

Tableau 2: caractéristiques des phénotypes de résistance acquis aux aminosides chez E.

coli
Phénotype
Gentamicine Tobramycine Netilmicine Amikacine Enzyme
G I/R S S S AAC (3) -
1
GT I/R I/R S S ANT (2)
 GTNt R R I/R S AAC (3) -
II ou V
TNA S I/R I/R I/R ACC (6) -
1
Imperméabilité I/R R R I/R

Phénotype G (résistant à la gentamicine)

Phénotype GT (résistant à la gentamycine et la tobramycine)

Phénotype GTN (résistant à la gentamycine,la tobramicine et la netilmicine)

Phénotype TNA (résistant à la tobramycine, la netilmicine et l’amikacine)

Phénotype d’imperméabili té (résistant à tous les aminosides)

b. Les phénotypes de résistances de E. Coli aux Quinolones acquissent

Tableau 3: caractéristiques des phénotypes de résistance acquis aux quinolones chez E.

Coli
Phénotype
Modification de la Déficit Efflux GyrA+ParC+Deficit
cible en en porine et/ou
GyrA GyrA+ParC porine efflux
Quinolones de R R I/R S R
1ere
generation
Norfloxacine I R S R R
Ofloxacine ou S/I R S S R
Levrofloxacin
e
Ciprofloxacine S S/I I/S I/S R

Phnoype de modification de la cible GyrA

Phénotype de modification de la cible Cyra + ParC

Phénotype deficit de porines

Efflux

12.Antibiogramme et détermination de la CMI des carbapénèmes sur E.

coli.
Un antibiotique est une substance naturelle, synthétique ou semi synthétique capable
d’empêcher la croissance bactérienne (bactériostatique) ou de les tuer (bactéricide).
Cependant, le laboratoire de bactériologie dispose de nombreux tests de sensibilité des
bactéries vis-à-vis des molécules d'antibiotiques en particulier celles inscrites dans la
nomenclature internationale et ceci dans le but de détecter les résistances bactériennes et
d'aider à la prise en charge thérapeutique des patients. La sensibilité d'une bactérie est
mesurée par la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique considéré. C'est la
méthode de référence préconisée par l'OMS. Cette CMI est la plus petite quantité
d'antibiotique (ATB) capable d'inhiber une croissance visible à l'œil nue. Elle est déterminée
par différentes méthodes mais la méthode micro-dilution sur microplaque sera celle utilisée,
méthode de référence standardisée par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
(CLSI, 1999).

12.1 Détermination de la CMI en milieu liquide par micro-dilution

 Principe
La méthode micro-dilution repose sur la mise en culture d’une bactérie dans un
milieu liquide en présence d’une gamme de concentrations d’antibiotique d’ordre deux
(CLSI, 2012) à partir d’une solution mère d’antibiotique.

 Préparation d’un inoculum à 105 bactéries par ml

Les différentes souches conservées au réfrigérateur (4°C) dans le bouillon cœur-

cervelle seront réensemencées en stries sur milieu EMB ou gélose et incubées à 37°C
pendant 24h (vérification de la pureté de la souche). Ensuite deux colonies de la nouvelle
culture seront prélevées à l’aide d’une anse de platine et repiquées dans 9 ml de bouillon
nutritif et incubé à 37°C pendant 18h. Ce procédé nous permettra donc d’obtenir des souches
fraiches et pures de E. Coli correspondant à 106 UFC/ml de bouillon MH
L’inoculum bactérien sera préparé à partir de cette culture de 24 heures en milieu liquide.
Introduire 0,1 ml (3 gouttes de pipette Pasteur) de cette culture de la souche étudiée dans 25
ml de bouillon Mueller-Hinton. Au final, cette suspension correspondra à une concentration
bactérienne de 105 à 106 bactéries par ml et constituera l’inoculum. La gamme d’antibiotique
sera réalisée dans les cupules de la microplaqu

150 µl

E. Coli en bouillon nutritif incubé

25 ml de bouillon MH
à 18h à 37°C
Figure 6 : préparation de l'inoculum
 Méthode
L’inoculum standard sera mis en contact avec des concentrations croissantes en antibiotique
dans une microplaque de 96 puits (CLSI, 2012). Un puit contrôle sans antibiotique (témoin de
croissance) et un puit contrôle sans bactérie (témoin de stérilité) seront également préparés.
Nous prélèverons 200 µl de la solution mère de chacun des carbapénèmes préalablement
préparés et l’introduirons dans le puit 1 de la série initialement vide ; ensuite prélèverons 100
µl du puit 1 et transférons dans le puit 2 ; homogénéiserons l’ensemble antibiotique-
inoculum ; prélèverons à nouveau 100 µl de ce mélange pour le transférer au puit 3 (Morel,
e
2017). Nous ferons cela jusqu’au 7 puit et enfin nous rejetons l’excès. Après 18-24 h
d’incubation à 37 °C, la CMI est déterminée visuellement comme la plus petite concentration
d’antibiotique ayant inhibé la croissance visible de la souche bactérienne. Ceci permettra de
catégoriser divers antibiotiques sur une seule microplaque en testant une série de
concentrations encadrant les concentrations critiques, afin de déterminer si la souche
bactérienne est sensible, intermédiaire ou résistance à ces antibiotiques. Il sera également
possible de déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), la plus petite
concentration d’un antibiotique permettant de tuer le pathogène, à partir de cette méthode
(Seydina, 2016). Les puits dans lesquels aucune croissance ne sera visible seront ensemencés
sur des géloses afin de déterminer quelle est la concentration d’antibiotique qui a permis de
tuer 99.9% des bactéries. Un antibiotique sera dit bactéricide si sa CMB est inférieure à 4 fois
sa CMI, sinon il sera considéré comme bactériostatique
 Contrôle qualite

Le contrôle qualité se fera par ajout de 2 puits témoins dans chaque série de dilution, dans
lesquels 100 µl de l’inoculum bactérien seront introduit dans l’un (contrôle positif) et 100 µl
de l’antibiotique dans l’autre (contrôle négatif).

Tableau 4 : CMI connu sur E. coli en mg/l (CASFMV2021)

Antibiotiques Sigles Cible Limite acceptable

Ertapénème ERT 0,008 0,004-0,016

Imipénème IPM 0,125 0,06-0,25
Méropénème MER 0,016-0,03 0,008-0,06
Doripénème DOR 0,03 0,016-0,06

13. CONSIDERATIONS ETHIQUES ET ADMINISTRATIVES

Pour que notre étude réponde aux exigences de la recherche de l’éthique, nous obtiendrons :
 Une clairance éthique délivrée par le comité éthique de l’ESS / UCAC ;
 Une autorisation de mise en stage de collecte des données ou d’étude délivrée par le
directeur de l’ESS/UCAC ;
 Une autorisation de recherche du directeur de l’hôpital ;
 Une fiche d’information à l’attention de tous les participants ;
  Une validation de notre travail par notre directeur de mémoire.
a. Populations vulnérables

 Mineurs, majeurs inaptes et population carcérale

Les prélèvements seront issus des patients de tout âge mentalement et physiquement aptes å
donner leur consentement ou assentiment parental libre et éclairé.
 Liens de dépendance
Notre étude n’inclura pas des personnes ayant une relation client-professionnel, étudiant-
professeur, employé-employeur ou affective avec nous ou un membre de notre équipe de
recherche.
 Implication de la communauté d'appartenance
Notre recherche n'impliquera pas l'accord de la communauté sociale ou culturelle à laquelle
appartiennent les participants.

b. Compensation-incitatif-rémunération
Le projet ne prévoit pas une quelconque compensation ou rémunération pour les participants.
 Avantages
Cette étude contribuera à apporter une meilleure connaissance sur l’état actuel de la
résistance de E. Coli aux carbapénèmes ainsi que les nouveaux phénotypes de résistance,
réduire l’utilisation abusive des ATB et une orientation de l’antibiothérapie par les cliniciens.
 Risques et inconvénients de l’étude
Il n’existe aucun risques, inconvénients ou inconforts associés à la participation du recruté à
cette étude.
 Divulgation partielle des résultats
Uniquement les informations relatives à l'objet de la recherche seront mises à l'entière
disposition des responsables afin de leur permettre de mieux comprendre l'importance de ce
projet avant d'accorder leur consentement.
 Informations aux participants
Les résultats de la recherche seront communiqués à ces participants en envoyant si possible
des courriels ou en leur informant de la disponibilité de ces résultats à la bibliothèque de
l’Ecole des Sciences de la Santé.

c. Consentement écrit ou verbal

Durant cette recherche, nous obtiendrons un consentement écrit des responsables des
laboratoires des lieux de collecte de la recherche.

d. Protection des données à caractère personnel

Les données seront conservées sous support numérique et physique, dans des mails des
membres de l’équipe de recherche pour une période de cinq ans et détruit par suppression.

e. Confidentialité
Toutes les informations recueillies resteront confidentielles, aucune identification ne sera
faite même lors d’une éventuelle diffusion de l’étude que ce soit sous forme d’article, de
rapport de recherche ou autres.

f. Utilisation ultérieure des données

Les données seront accessibles sous forme de mémoire disponibles à la bibliothèque de
l'Ecole des Sciences de la Santé dans l'éventualité où ces dernières pourraient être utilisées
dans une recherche ultérieure.