Université de Tunis El Manar

Faculté des Sciences de Tunis

Département des Sciences Biologiques

Master Professionnel Co-construit

Technologies Cellulaires et Moléculaires en Biosanté

MP1Cc – 3ème Semestre (S3)

Support pédagogique de l’atelier 5 : Techniques

en Microbiologie

Préparé par :

KLIBI Naouel : Maitre de conférences , FST

ESSGHAIER Badiaa : Maitre-assistante, FST

Année Universitaire 2020-2021

 TP 1: Criblage des souches productrices des substances
antibactériennes

Introduction

Les antagonistes microbiens sont largement utilisés en médecine humaine et animale (les
antibiotiques) en agroalimentaire (conservation des aliments par les bactériocines) et en
agriculture (lutte biologique contre les microorganismes phytopathogènes).

Beaucoup de recherches ont été entreprises dans le monde entier, elles fournissent des
informations importantes sur la production d’antibactériens et d’antifongiques. Plusieurs
écosystèmes telluriques aquatiques ou autres ont fait l’objet de ces études. Les techniques
sont toujours employées afin de trouver des molécules nouvelles.

1. Mise en évidence de l’activité antibactérienne.

Les méthodes de détection des souches productrices de substances

antibactériennes (bactériocines et antibiotiques) sont basées sur la diffusion de ces
substances dans un milieu de culture solide ou semi-solide préalablement inoculé par une
souche indicatrice.

a- Test des spots (spot on the lawn) :

C’est une méthode permettant la recherche d’antagonisme de plusieurs souches à la fois,

cet antagonisme peut être soit direct (simultané) ou indirect (différé).
- Antagonisme direct : il consiste à réaliser sur une gélose un tapis de la souche indicatrice,
une culture fraîche de la souche test est ensuite ensemencée sur ce tapis sous forme de
spots. Après incubation, les boites sont examinées pour les zones d’inhibition. La densité du
tapis cellulaire est un facteur déterminant dans cette méthode (vérification de la courbe de
croissance).
- Antagonisme différé : dans cette méthode, une préculture de la souche test est
ensemencée sur gélose sous forme de spots, une incubation est alors réalisée permettant le
développement des colonies. Une gélose molle (0.75% d’agar) inoculée par un certain
volume de la souche indicatrice est ensuite versée au-dessus (10µl -20µl). L’inhibition se
traduit par l’apparition des halos d’inhibition (≥2mm) autour des souches productrices.

b- Méthode des puits

Cette méthode proposée par Barefoot et Klaenhammer (1983) consiste à inoculer la gélose
fondue et refroidie à 45°C avec une préculture de la souche indicatrice. Après solidification,
des puits sont creusés à l’aide d’un emporte-pièce ou un embout, puis remplis avec le
surnageant préalablement stérilisé par filtration sur membrane de la culture à tester. Une
pré-diffusion à 4°C durant 4H est réalisée suivie d’une incubation de 24H à 48H avant
examen des zones d’inhibition. Une modification de cette méthode consiste à remplir les
puits par une gélose contenant la souche à tester.

c- Méthode des disques

Dans cette méthode, un tapis de la souche indicatrice est réalisé sur la surface d’un milieu
solide, ensuite des disques stériles de papier Whatman imbibés de surnageant de la culture à
tester sont déposés sur ce tapis. Après incubation, les boites sont examinées pour la
présence des zones d’inhibition.

d- Méthode de plaques de gélose :

Dans cette méthode la gélose est inoculée par 1ml de la souche à tester et incubée pendant
24H. Des plaques sont découpées de cette gélose puis placées sur une autre gélose inoculée
de 0.5ml de la souche indicatrice. Après incubation, les boites sont examinées pour visualiser
les zones d’inhibition

e- Méthode des microplaques

Cette méthode consiste à placer 25µl du surnageant de la souche à tester dans les cupules
d’une microplaque, ensuite chaque cupule reçoit un volume de 175µl de bouillon approprié
inoculé par 1% (v/v) d’une préculture de la souche indicatrice. Après incubation à la
température optimale de cette dernière durant 20H, la croissance est examinée en mesurant
la densité optique à 650nm.

2. Manipulation

Dans ce TP, on se propose d’isoler des microorganismes (bactéries ou champignons) à partir

de différents échantillons de sols capables de sécréter des substances antibactériennes.

A. Matériel utilisé

1- Milieux de culture
 Gélose nutritive
 BHI bouillon
 Agar-agar
2- Appareillage :
 Autoclave
 Etuve bactériologique
 Vortex
 Balance de précision
 Bain marie
 Plaque chauffante agitante
 Micropipette 0.5 à 10µl
 3- Matériel biologique : Escherichia coli ;Bacillus subtilis ;Enterococcus faecalis

B. Méthodologie

La sélection des souches de bactéries telluriques ayant une activité antibactérienne sera
réalisée par le procédé d’antagonisme différé en utilisant la méthode des spots dite sur tapis
cellulaire.
Les échantillons du sol dilués (10-1 à 10-6) dans l’eau physiologique (9%о NaCl) sont
ensemencés par étalement sur gélose PCA et ensuite incubés à 37° pendant 24H à 48H. (TP
n=1)

Les colonies isolées sur gélose de PCA sont testées pour leur activité antagoniste vis-à-vis de
trois souches de référence.
Les boîtes présentant des colonies bien isolées sont recouvertes de 10 ml d'une gélose molle
de BHI (0.75% d’agar) préalablement préparée de la façon suivante : la gélose fondue est
refroidie à 45 C puis ensemencée de 20 µl d’une culture pure de la souche de
référence dans un bouillon BHI.
Après solidification, les boîtes de Pétri sont incubées pendant 24 h à 37C.

C. Résultats
Test Résultats attendus Exploitation des résultats
d’antagonisme
différé

Les colonies entourées d'une zone

Utilisation d’une claire dans la nappe de culture de la
double gélose souche de référence sont purifiées
1. Gélose de BHI : par des repiquages successifs sur une
(souche gélose nutritive
indicatrice) Gélose de BHI

2. Gélose de PCA N.B Les souches ainsi purifiées seront

(souches à tester) conservées dans des tubes à essais
contenant un milieu GN pour une
Gélose de PCA
identification biochimique et
moléculaire (TP n=3)

Travail effectué par les étudiants ( par trinômes)

1. Isolement des bactéries à partir d’un échantillon du sol (colonies utilisées pour TP2)
2. Recherche d’un antibiotique et d’un antifongique par les méthodes de puits et de spots et
de disque (direct ou différenciée)
3. Analyse des résultats en TP2)

CR1
 TP 2: Caractérisation phénotypique des souches isolées :
- Souches d'intérêt pour la production des substances antibactériennes

1- Introduction

L’identification consiste à placer un individu particulier dans un taxon connu. La

reconnaissance des espèces par les procédés d’identification est basée sur les propriétés
phylogéniques ou biochimiques de plusieurs souches jugées comme représentatives. La
technique d’identification absolue est l’hybridation ADN/ADN, mais elle n’est pas utilisable
en routine. L’utilisation du séquençage ne se justifie pas pour chaque germe isolé à
identifier, d’autres méthodes moins absolues et bien employées sont aussi satisfaisantes.

2- Définitions : espèce bactérienne, souche bactérienne et rang taxonomique

 ESPECE BACTERIENNE

Une espèce bactérienne se définit comme un ensemble de souches ayant en commun de

nombreuses propriétés stables et étant différente de façon significative des autres groupes
de souches. Les espèces présentant des propriétés communes sont regroupées dans une
catégorie supérieure, le genre. En bactériologie, une espèce est constituée par sa souche
type et par l’ensemble des souches considérées comme suffisamment proches de la souche
type pour être incluses au sein de la même espèce. La notion d’espèce bactérienne a été
réévaluée par l’ICSP en Février 2002. La définition actuelle de l’espèce est phylogénétique.
Elle se base sur les homologies ADN-ADN, applicables à toutes les espèces. Elle porte sur
l’ensemble du génome (plasmides exceptés), et n’est que peu ou pas affecté par les
mutations ou par la présence de plasmides. Une espèce est définie phylogénétiquement
comme le rassemblement des souches ayant des relations ADN-ADN avec des valeurs
d’hybridation > à 70% et par une valeur DTm(e) < à 5°C. Il reste nécessaire de disposer de
caractères phénotypiques (et/ou génomiques) fiables et faciles à mettre en évidence pour
donner un nom à une espèce. S’ils existent, elle reçoit un nom et devient une espèce, sinon,
elle demeure innomée.

 SOUCHE BACTERIENNE

Une souche est une population d’organismes descendant d’un organisme unique ou d’un
isolat de culture pure. Au sein d’une même espèce les souches peuvent présenter des
différences légères entre elles qui pourront être caractérisées sur la base :
- de leurs propriétés biochimiques ou physiologiques pour les biovars
- de leurs propriétés antigéniques pour les sérovars
- de leur facteur de virulence pour les pathovars
  RANGS TAXONOMIQUE

En nomenclature biologique, on nomme rangs taxinomiques, ou rangs taxonomiques, les

niveaux hiérarchiques de la classification scientifique du monde vivant, qui du règne à
l'espèce, forment les étages de la pyramide accueillant les taxons de la systématique d'un
groupe donné de champignons, de protistes, de bactéries ou d’archéobactéries.
La classification classique propose une hiérarchie codifiée en 7 rangs principaux et
des rangs secondaires, présentée, dans l'ordre décroissant, de la façon suivante :

Règne → domaine→ phylum → classe → ordre → famille → genre→ espèce → variété

Exemple de rangs taxonomiques et de noms : Classification d’Escherichia coli :

- règne : Procaryotae
- domaine : Bacteria
- phylum : Proteobacteria
- classe : Gammaproteobacteria
- ordre : Enterobacteriales
- famille : Enterobacteriaceae
- genre : Escherichia
- espèce : Escherichia coli

3- Identification phénotypique

L’identification phénotypique utilise un certain nombre de caractères considérés comme

importants. Les bactéries peuvent ainsi être identifiées en fonction :
- de leur morphologie macroscopique (taille, forme, couleur... des colonies sur milieux de
culture gélosés)
- de leur mobilité (mobilité ou immobilité à une température donnée)
- de la présence de spores (à l'état frais ou après coloration)
- du résultat de la coloration de Gram (coloration de Gram positive ou négative)
- de la température de croissance (4° C, 20° C, 30° C, 37° C...)
- du type respiratoire (aérobie, anaérobie strict, aéro-anaérobie facultatif, microaérophile..)
- des besoins nutritionnels (nécessité de substances particulière pour le développement)
- de la capacité à utiliser certaines sources de carbone ou d’azote

N.B : Il est faut garder à l’esprit que ces caractères peuvent être absents notamment chez
les germes mutants. Ex : existence de souches d’ E.coli lactose -.
Une liste (non exhaustive) des caractères phénotypiques couramment employées est détaillée
dans le tableau suivant.

Observations et tests préliminaires Coloration (Gram, bleu de méthylène…)

Morphologie (bacille, coque..) Mobilité
Présence de spores (déformantes,
 terminales)
Croissance en aérobiose/anaérobiose
Hémolyse sur gélose au sang Production
d’une catalase
Tests métaboliques Test à l’oxydase
Test à l’uréase
Test de l’indole
Production d’H2S
Sérologie Agglutination
Immunochromatographie
Test d’inhibition Milieux sélectifs
Antibiotiques

3. Manipulation

A. Coloration de Gram :

La coloration de Gram est fréquemment utilisée en microbiologie pour mettre en évidence

les bactéries Gram positif/négatif. Cette méthode de coloration repose sur une différence
fondamentale entre la composition chimique des parois des bactéries à Gram positif et à
Gram négatif. En effet, la paroi s'interpose comme une barrière pour empêcher l'accès du
cytoplasme (sur lequel se fixerait le colorant) aux agents décolorants et à l'élution du
complexe coloré. L'incapacité des cellules à Gram négatif à interdire cet accès résulte de la
teneur élevée de leurs parois en lipides qui sont facilement dissous dans l'alcool ; celui-ci
passe alors facilement à travers la membrane cellulaire, dissout le complexe coloré, l'élimine
et laisse la cellule incolore. Cette différence de structure explique en outre que certains
antibiotiques n'agissent que sur les bactéries à Gram positif, d'autres que sur les bactéries à
Gram négatif. C'est une justification de plus à cette division des bactéries en deux grands
groupes.

Etape 1 : réalisation d'un frottis :

a) A partir d'un bouillon : déposer au centre de la lame 1 goutte de bouillon ; étaler
b) A partir d'un isolement sur gélose : déposer une petite goutte d'eau (flacon du portoir à
colorants) au centre de la lame. Faire une suspension homogène avec une seule colonie
prélevée à l'anse. Etaler sur environ ¼ de la lame.
- Laisser sécher en chauffant légèrement la lame au-dessus de la flamme. Ne pas brûler les
bactéries sinon l'observation sera délicate voire impossible. La lame doit être totalement
sèche.
- Fixer le frottis en versant 1 ou 2 gouttes (pas plus) d'alcool 100° sur la lame et enflammer à
l'aide d'une allumette.
- Laisser refroidir.
Etape 2 : coloration au violet de Gentiane suivie d'un mordançage par une solution iodo-
iodurée de Lugol
- Recouvrir toute la lame de Violet de Gentiane. Laisser 1 minute.
- Chasser le violet avec le Lugol. Laisser 1 minute.
- Rincer à l’eau. Egoutter la lame.

Etape 3 : décoloration à l'alcool

- Recouvrir la lame d'alcool 100°. Attendre 15 secondes.
- Rincer immédiatement à l’eau. Laisser un peu d'eau sur la lame.
Etape 4 : recoloration à la fuchsine.
- Mettre 2 gouttes de Fuchsine. Laisser 1 minute.
- Laver abondamment à l'eau.
- Sécher délicatement la lame dans un papier jetable. Nettoyer au besoin le dessous de la
lame avec un papier jetable . La lame doit être totalement sèche.
- Observer à l'immersion en pleine lumière : Mettre une goutte d'huile à immersion sur la
lame totalement sèche. Observer à l'objectif x 100 (objectif à immersion). Ouvrir le
diaphragme. (Monter le condensateur si le microscope le permet). L’objectif doit toucher la
goutte d’huile.

Test KoH : (solution 3%KOH) : permet aussi la distinction des GRAM- et GRAM+ :
Ce test permet la lyse des cellules gram-, et la libération de l’ADN qui est visqueux, par
contre les gram+ restes intacts :

Détection rapide des gram- : Observation d’un filament visqueux (après addition d’une
goutte de KOH et des cellules gram-

B. Identification biochimique :
L'identification biochimique est un examen qui permet d'identifier une bactérie en
s'appuyant sur ces caractères biochimiques.

Fermentation de deux sucres (lactose/ glucose) et production de gaz (Milieu

de Kligler-Hajna)

Le milieu Kligler-Hajna est utilisé pour l’identification des entérobactéries en se basant sur
l’utilisation de deux sucres (fermentation de glucose, oxydation du lactose) avec citrate
ferrique comme indicateur de détection du sulfure d’hydrogène (H2S).
L’ensemencement d’un tube du milieu Kligler–Hajna par E. coli donne après incubation à
37°C trois résultats:
1) Fermentation du glucose (culot) et du lactose (pente): couleur jaune
2) Production de gaz: bulle d’air pouvant fragmenter la gélose ou la décoller
3) Pas de production de H2S (absence de précipité noir de sulfure de fer à la limite de la
pente et du culot).
 Kligler Hajna
1- lecture de la production d’H2 S 2- lecture de la production de gaz

Pas de précipité
Précipité noir
noir Présence de bulles Pas de bulle dans
de sulfure ferrique
bactéries ! dans la gélose la gélose
Production H2S-
d’H2S par Les bactéries
bactéries !
produisent du GAZ -
les bactéries gaz (H2 ou
! H2S+
CO2) au cours
de leur
fermentation :
GAZ +

Le milieu citrate de Simmons :

Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate comme seule source de

carbone et d'énergie. Ce caractère est intéressant pour discriminer les bactéries entre-elles
et ainsi de les identifier.
Le milieu de mannitol mobilité :

La présence d’une faible teneur d’agar (gélose semi-molle) rend possible le déplacement des
bactéries mobiles autour de la piqûre centrale.
La lecture de l’utilisation du mannitol est possible grâce à la présence d’un indicateur de pH,
le rouge de phénol. L’utilisation du mannitol acidifie le milieu qui peut ainsi être révélé par le
virage de l’indicateur de pH à sa teinte acide (jaune). La présence de nitrate de potassium
permet la recherche de la nitrate réductase.
Technique d’ensemencement : Par piqûre centrale à l’aide d’une pipette Pasteur fermée.
Incuber 24 heures à 37°C.

Milieu urée-indole :

Le milieu Urée-Indole permet de rechercher l’uréase et la production d’indole. La production

de l’uréase par la bactérie provoque une réaction acidifiant le milieu qui fait virer l’indicateur
coloré. La présence d’indole donne après addition de réactif de Kovacs une coloration rouge
à la partie supérieure du milieu.

La lecture des résultats se fait après 24h d’incubation à 37°C du milieu Urée-Indole
abondement ensemencé à partir d’une culture pure de l’isolat prélevé sur milieu gélosé
BHIA (Annexe). Dans le cas des E. coli on note une absence de virage après 24h (absence
d’uréase) et une coloration rouge suite à l’addition de réactif de Kovacs (production
d’indole).
 - Recherche de la TryptophaneDésaminase:
TDA TD
Tryptophane + H2O Acide Indole pyruvique
A

Quelques gouttes
de chlorure de Fer
III

Urée
Indole
 Si précipité marron: la bactérie a dégradé la tryptophane
avec la tryptophane désaminase  TDA +
 Absence de précipité : La bactérie n'a pas dégradé la
tryptophane avec la TDA  TDA-
C. Etude de la sensibilité aux antibiotiques : Antibiogramme

La détermination de la sensibilité aux antibiotiques est réalisée par la méthode de diffusion

en gélose Mueller-Hinton (MH) selon les recommandations du CLSI «Clinical Laboratory
Standards Institute 2013». Cette technique présente des étapes rigoureusement standardisées.

Principe
Cette technique utilise des disques de papier buvard imprégnés d'une concentration donnée
d'antibiotique déposé à la surface d'une gélose spécifique (Muller Hinton) coulée en boîte de
pétri uniformément ensemencée d'une suspension de la bactérie étudiée.
Après incubation il s'établit un gradient de concentration de l'antibiotique. L'interaction
entre la bactérie et l'antibiotique s'exprime par une zone d'inhibition dont le diamètre est
une ex pression indirecte de la CMI. La souche bactérienne testée est classée en fonction du
diamètre d'inhibition dans la catégorie S (sensible), R (résistante) ou I (intermédiare).

Méthodologie

1. Quelques colonies (deux à trois) d’une culture jeune de 24h sur milieu BHIA sont
suspendues dans 5 ml d’eau physiologique afin d’obtenir une suspension bactérienne de 0,5
Mac Ferland (≈108 UFC/ml).
2. Les disques d’antibiotiques sont appliqués à la surface de la gélose MH inoculée à partir
de cette suspension par inondation.
3. La lecture est réalisée après 16 à 18h d’incubation à 37°C par la mesure des diamètres
d’inhibition observés.
.
Travail effectué par les étudiants : (TP2) : travail par trinôme

4. Caractérisation des bactéries : mobilité, forme cellulaire, arrangement cellulaire)

5. Observation des levures (Saccharomyces pombe…)
6. Détection des bactéries gram- par le test KOH
7. Antibiogramme des bactéries de référence
8. Test de mobilité sur Mannitol mobilité

CR2
 TP 3: Caractérisation moléculaire des souches isolées :
- Souches d'intérêt pour la production des substances antibactériennes

Introduction
L’identification bactérienne se fait traditionnellement à partir des caractères phénotypiques
de la bactérie : coloration (de Gram par exemple), morphologie, aptitude à croitre sur
certains milieux de culture, caractères biochimiques détectés par diverses techniques
commerciales (galeries API, systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…). Toutefois certaines bactéries
sont mal identifiées phénotypiquement pour diverses raisons. En effet, certaines bactéries
expriment peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres espèces, une situation de stress
peut avoir altéré les caractères phénotypiques. Une identification basée exclusivement sur
des caractères phénotypiques peut donc mener à un résultat erroné. Enfin, pour certaines
bactéries à croissance difficile les caractères phénotypiques sont difficiles à déceler ; la
biologie moléculaire simplifie dans ce cas l’identification. Dans ces situations les outils
moléculaires ont démontré leur efficacité pour l’identification bactérienne. Il s’agit de
méthodes universelles, précises et objectives, dont la variabilité est limitée par rapport aux
techniques conventionnelles

La technique d’amplification in vitro PCR

1. Définition
La PCR ou Polymerase Chain Reaction (la réaction en chaîne par polymérase) est une
technique qui permet d’amplifier l’ADN ou l’ARN in vitro. Elle a été développée par Kary
Bank Mullis (prix Nobel de chimie en 1993).
2. Identification moléculaire par amplification de l’ADNr 16S
la PCR universelle ADNr 16s, ayant pour cible une séquence d'ADN commune à toutes les
bactéries, le gène codant pour l'ARNr 16s, permet l'identification de n'importe qu'elle
espèce bactérienne. Ces gènes sont présents en plusieurs copies au sein de chaque
organisme. Certaines bactéries ne sont connues que par la séquence de leur gène 16S.
3. Amplification des régions spécifiques
Certains gènes de structure sont considérés comme des marqueurs génétiques
caractéristiques d’une espèce bactérienne donnée. Ils sont utilisés comme outils
d’identification moléculaire. Le gène de structure de la β-glucuronidase (uidA) est un
marqueur génétique caractéristique de l’espèce E.coli. L’amplification de ce gène avec le
couple d’amorce uidA-F (5’-ATCACCGTGGTGACGCATGTCGC-3’) et uidA-R (5’-
CACCACGATGCCATGTTCATCTGC-3’) permet la confirmation de l’identification biochimique
des isolats E.coli .
2. Principe de la réaction PCR
La PCR se base sur le principe suivant :
• Connaître d’abord les fragments (20 nucléotides) qui encadrent la séquence d’ADN à
amplifier.
• Synthèse de séquences complémentaires à ces fragments : ce sont les amorces
oligonucléotidiques.
• L’ADN polymérase commence la synthèse des brins complémentaires grâce aux amorces et
le nombre de copies de la séquence d’ADN est doublé pour chaque réplication.

3. Le mélange réactionnel
La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui
comprend Les éléments nécessaires à cette réplication, à savoir :
 L’extrait d’ADN (ADN matriciel)
 l’enzyme Taq polymérase : c’est une polymérase thermostable, extraite d’une
bactérie (Thermus aquaticus) des sources chaudes (80-90°C).
 les nucléotides triphosphates : Au départ on utilisait des concentrations qui allaient
jusqu’à 1,5 mM. Mais cette concentration cause des amplifications parasites dues
aux erreurs de réplication. Les concentrations de 0.1 à 0.2 mΜ sont de plus en plus
utilisées.
 les amorces : ces oligonucléotides initient le travail de la Taq polymérase. Leur Tm
est de 5°C de moins que la température d’hybridation. Généralement, ce sont les
valeurs comprises entre 55 et 70°C qui donnent de bons résultats avec de
concentrations de 0,1 à 0,5μM.
 les ions magnésium : A des concentrations de 0,5 à 2,5 mM, ils servent de
stabilisateurs pour les nucléotides et activent l’enzyme.
Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à des cycles de température
réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d’un thermocycleur (appareil qui
comporte une enceinte où l’on dépose les tubes échantillons et dans laquelle la température
peut varier, très rapidement et précisément, de 0 à 100°C par effet Peltier). L’appareil
permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de
température. Chaque cycle comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes.
Couvercle

Enceinte

Thermocycleur
4. Cycles de température et réalisation de la PCR

La dénaturation initiale : 95°C

L’ADN à amplifier est chauffé à une température supérieure à sa Tm (en pratique, environ
95°C) pour séparer les deux brins.
La dénaturation : 94°C
La première période s’effectue à une température de 94°C, dite température de
dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la
réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une
température supérieure à 80°C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin
(ADN monocaténaires).

L’hybridation : 40 – 70°C
La deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C,
dite température d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux
liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les
amorces, courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent
l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel. Plus la
température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est
spécifique.

L’élongation : 72°C
La troisième période s’effectue à une température de 72°C, dite température d’élongation. À
72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en
utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les
régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées. Au
cycle suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice et
au bout de quelques cycles, l’espèce prédominante correspond à la séquence d’ADN
comprise entre les régions où les amorces s’hybrident. Il faut compter 20 à 40 cycles pour
synthétiser une quantité analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit
théoriquement doubler la quantité d’ADN présente au cours du cycle précédent.

L’élongation finale : 72°C

Il est recommandé de rajouter un cycle final d’élongation à 72°C, notamment lorsque la
séquence d’intérêt est de grande taille (supérieure à 1 kilobase).
5. Fiche de manipulation PCR
Fiche Manipulation : PCR
Date :

Constituants (CC Stock) CC finale Vol./Réaction Master mix (nbr échant.)

Tampon PCR 10X 1X
MgCl2 25mM 2.5mM
Dntp 25mM 0.2mM
Amorce F: 25µM 0.5µM
Amorce R: 25µM 0.5µM
Taq pol. 5U/µl 1U/tube
ADN
qsp H2O Vol. final :
Autres:
Vf =25µl

Programme PCR : Numéros : Nbre cycle

Dénaturation initiale : Température : 94°C 1
Temps : 4 min
Elongation : Tps 94°C 55°C 72°C 35
T°C 1 min 45 sec 1 min
Elongation finale Température : 72°C 1
Temps : 7 min

Souches analysées :

Nature ADN : Génomique

CR3 : Questions théoriques

 TP 4: Méthodes des analyses des contaminations de
l’environnement (des locaux, des surfaces, des équipements)

I. Termes et définitions

Nettoyage :

Opération qui a pour but de rendre physiquement propre les surfaces en les débarrassant de
leurs souillures visibles (physiques ou chimiques ). Une surface ainsi nettoyée est alors
qualifiée de physiquement propre. Dans le cas d'une surface alimentaire, le nettoyage a pour
but de la rendre apte à être facilement désinfectée.

Le nettoyage, dans l’industrie pharmaceutique, peut être considéré comme l’action de séparer
et d’éliminer des souillures généralement visibles d’une surface. Ainsi, l’objectif premier du
nettoyage mis en œuvre dans les industries pharmaceutiques est d’éliminer les contaminants
présents sur les différents équipements du procédé de fabrication afin de réduire les risques de
contamination croisée du produit (F.Sliwinski, 1995).
L’enjeu du nettoyage dans l’industrie pharmaceutique est d’une importance capitale. Tout
produit fini contaminé et délivré par une entreprise cosmétique ou pharmaceutique peut avoir
une incidence majeure sur la sécurité de l’utilisateur.

Les principes du nettoyage dans l’industrie pharmaceutique

Communément, le nettoyage dans les industries pharmaceutiques et / ou cosmétiques repose

sur 10 principes fondamentaux qu’il faut suivre et respecter :
1. Le procédé de nettoyage doit être compatible avec les activités de production, avec la classe
d’air du local et avec le niveau de propreté que l’on souhaite atteindre ;
2. Le nettoyage doit éliminer les souillures et non les diluer ;
3. Le nettoyage ne doit pas altérer les surfaces à nettoyer ;
4. Le nettoyage ne doit pas engendrer de contaminations croisées ;
5. Le nettoyage élimine plus de contaminations qu’il n’en apporte ;
6. Le nettoyage s’effectue du moins sale vers le plus sale, et de haut en bas ;
7. Le nettoyage s’effectue dans le sens de l’air et de la gravité ;
8. Le nettoyage s’effectue de la zone la plus sensible vers la zone la moins sensible ;
9. Le nettoyage réalisé fait l’objet de procédures approuvées ;
10. Les opérateurs de nettoyage sont correctement formés aux règles de sécurité, d’hygiène et
de nettoyage.

C’est à partir de ces 10 principes que peuvent souvent être identifiées les problématiques de
nettoyage sur un site pharmaceutique.
Désinfection : Opération au résultat momentané permettant d'éliminer ou de tuer les micro-
organismes et/ou d'inactiver les virus indésirables sur les milieux inertes contaminés, en
fonction des objectifs fixés.

De nos jours, le problème du nettoyage et de la désinfection est étroitement lié à l'hygiène.

L’homme abrite naturellement une importante flore microbienne localisée notamment au
niveau de la peau, des muqueuses et de l’ensemble des cavités digestives. Cette flore est
composée de germes banals et également de germes potentiellement pathogènes s’ils sont
introduits dans les produits. Enfin l’homme peut, au cours des manipulations, souiller les
produits par l’intermédiaire de corps étrangers (cheveux, bijoux, boutons des vêtements...).

Contaminations
Un produit fabriqué, peut être soumis à des risques de contaminations par des souillures tout
le long de son procédé de fabrication et de conditionnement. Ces souillures peuvent donc être
responsables du phénomène de contamination croisée. La contamination croisée peut être
définie comme la contamination d’un produit sain par des poussières, gaz, vapeurs, aérosols,
ou organismes issus d’autres produits, de matériel du procédé, d’opérateurs, de vêtements ou
encore des locaux (Baricault, 2014.). il existe deux types :

 La contamination successive, qui peut être présente lorsqu’un équipement de fabrication ou

de conditionnement est destiné à produire plusieurs produits différents. Ainsi, pour ce type de
contamination croisée, le produit en cours de production est souillé par des résidus du produit
précédemment présent sur l’équipement. Les degrés de risque pour le consommateur seront
entièrement dépendants de la nature des produits fabriqués ;
 La contamination simultanée, qui est caractérisée par la contamination d’un produit fabriqué
sur un équipement par un autre produit, fabriqué simultanément sur un autre équipement
proche. Les facteurs humain et matériel sont ici prépondérants.

Différents types de souillures peuvent donc être à l’origine de la contamination du produit.

Elles peuvent être de nature particulaire (physique), chimique ou microbiologique (Bureau
pour la connaissance des marchés industriels (BCMI), 2005). Le nettoyage et la désinfection
ont donc pour vocation d’éliminer ces souillures, avec une efficacité plus ou moins prononcée
sur chacune d’entre elles.

La distinction entre les détergents et les désinfectants

Les détergents sont des agents chimiques permettant le nettoyage des sols ou des surfaces. Ils
contiennent des agents de surface, aussi appelés "tensio-actifs" qui ont pour but de détacher
les salissures de leur support, de les maintenir en suspension afin de les disperser dans la
phase liquide. Une mousse plus ou moins compacte sera ainsi créée.
Un détergent a quatre caractéristiques: (pouvoir mouillant ; pouvoir émulsifiant ; pouvoir
dispersant ; et pouvoir moussant).
On retrouve ce produit sous différentes formes : liquide concentré, poudre, capsules ou
granulés. Il est efficace si, lors de son utilisation, le principe du TACT est respecté :
Température, Action mécanique (frottement des surfaces, brossage...), Concentration (action
entre le produit et la salissure) et Temps d'application (durée de contact). Les facteurs qui
interviennent dans le nettoyage sont regroupés dans un cercle appelé « cercle de Sinner » ou
TACT (Température, Action mécanique, Chimie, Temps).
 Cercle de Sinner/TACT

1. Principe du nettoyage et de désinfection

Le nettoyage et la désinfection ont comme but:

• d'éliminer les souillures organiques et minérales de façon à obtenir une surface
physiquement et chimiquement propre.
• la destruction des micro-organismes de façon à obtenir une surface biologiquement propre.
Une politique d'hygiène mal adaptée se traduit par une augmentation de la contamination
biologique avec possibilité de développement de micro-organismes pathogènes (Salmonelles,
streptocoques) entraînant un risque de toxi-infection.

1. Différentes méthodes de contrôle de la propreté des surfaces

De nombreuses méthodes de mesures de la contamination des surfaces sont aujourd'hui

proposées. Certaines d'entre elles sont couramment utilisées dans les entreprises alors que
d'autres sont uniquement employées dans le cadre d'expérimentations en raison de leur mise
en œuvre trop lourde. Parmi ces dernières, nous pouvons citer la technique de brossage-
lavage-récupération, la méthode de rinçage par un liquide de suivi, la technique de
recouvrement de surfaces par gélose, ou encore, la recherche des protéines présentes sur les
surfaces. Ces méthodes permettent, soit à apprécier la contamination des surfaces, soit à
comparer ou apprécier l'efficacité d'autres méthodes :

2.1. L’écouvillonnage : Cette méthode consiste en un prélèvement d'une surface déterminée

avec un écouvillon en cellulose, stérile et humide. Cette technique permet de rechercher toutes
les flores désirées et autorise des dénombrements.

2.2. Chiffonnage : Une variante à l'écouvillon est l'utilisation de chifonnettes. La chifonnette

est un tissu de coton, stérile et préalablement imbibé par un milieu de culture spécifique de la
flore à analyser. Au laboratoire, un volume déterminé de liquide contenu dans la chifonnette
est récupéré puis ensemencé. Elle est cependant intéressante pour la recherche de certains
germes spécifiques comme les Salmonelles ou le Listéria ainsi que pour tester des surfaces
non planes ou non accessibles par d'autres méthodes de prélèvement.

1.1 Principe d’écouvillonnage : Le principe d’écouvillonnage se diffère selon la

surface à prélever :

Surface plane :
La surface de 100 cm2 est prélevée par un écouvillon imbibé avec le solvant.
Le solvant utilisé est l’eau purifiée.
1 : l’écouvillon sert à balayer la surface dans le sens horizontale avec le coté recto.
2 : l’écouvillon est retourné côté verso et le prélèvement se fait dans le sens vertical.
 Principe de la méthode de prélèvement par écouvillonnage.

Surface incurvée :
Si la surface est incurvée, elle est prélevée en utilisant un écouvillon imbibé dans
l’eau purifiée. Deux mouvements sont réalisés : le premier mouvement d’essuyage
en spirale avec le côté recto, et le deuxième mouvement se fait de la même façon que
le premier prélèvement mais dans le sens inverse.

Principe de prélèvement à partir d’une surface incurvée par écouvillonnage.

2.3. Méthodes par imprégnation de gélose : Elles consistent en l'application sur une surface
donnée d'une gélose spécifique des germes recherchés. Après incubation, la lecture se fait
directement sur le milieu gélosé. Trois modes de prélèvement existent:
• la boîte de contact: c'est une boîte plastique contenant une gélose nutritive coulée de
manière à former un ménisque convexe de 1 à 2 mm d'épaisseur.
• le Pétrifilm : il est composé de deux feuillets perméables et contient, sous forme
déshydratée, le milieu de culture associé à un agent gélifiant. La quantité de milieu disponible
pour la croissance bactérienne est faible dans le cas du Pétrifilm et ne s'applique pas sur les
surfaces non planes de même que la boîte de contact.

• les lames de surfaces: (LIOFILCHEM) elles sont constituées d'une lame de plastique biface
recouverte d'une gélose nutritive. Elles existent actuellement pour la recherche de la flore
totale, des coliformes, des levures-moisissures. Pour certaines (lames HygicultNO), les deux
faces de la lame sont équivalentes alors que pour d'autres (lames HumeauNO), elles
contiennent des milieux différents. Le principe d'utilisation et les réserves sont les mêmes que
pour la boîte de contact.
 Diagramme de nettoyage et de désinfection

MANIPULATION

1. Méthode d'échantillonnage
Par écouvillonnage

2. Analyse bactériologique des surfaces

2.1. Préparation de l'échantillon

La méthode d'écouvillonnage est utilisée parce qu'elle s'applique à tous les types de surfaces
et permet de prélever des surfaces difficilement accessibles. A l'aide d'un écouvillon de coton
stérile et humide, on balaie 25 cm2 de surface à analyser grâce à un gabarit.

2.2. Dilution
L'écouvillon est ensuite transféré dans 5 ml d'eau peptonée tamponnée stérile. Les germes
sont dispersés par un agitateur. 1ml de ce liquide est ensuite ensemencé dans une boîte de
Pétri coulée avec un milieu de culture.

2.3. Germes recherchés

La recherche de germes porte sur: les coliformes fécaux à 44°C et la flore mésophile aérobie
totale à 30°C.
2.4. Dénombrement

• Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale à 30°C: Le milieu spécifique est la

gélose Plate Count Agar (PCA) ou gélose de standard pour dénombrement.
1 ml est prélevé dans la dilution et transvasé dans une boîte de Pétri stérile.
De la gélose PCA est ajoutée dans la boîte. L'homogénéisation se faisant par des mouvements
rotatifs dans les deux sens. La boîte est refermée sur la paillasse pour permettre la
solidification. Après une seconde couche de PCA sera coulée en fin d'éviter un envahissement
de la surface par les germes contaminants ce qui rendra la lecture difficile. Les boîtes coulées,
sont incubées à 30°C pendant 72 h ± 3 h.
Les micro-organismes aérobies ont un aspect blanchâtre, arrondi, bombé ou plat.

• Dénombrement des coliformes fécaux à 44°C: Nous effectuerons la même chose que le
dénombrement de la flore totale mais ici, les boîtes sont incubées à 44°C pendant 24 h ± 2 h.
Les colonies apparaissent rouge foncé avec un diamètre supérieur à 0,5 mm. Le milieu
spécifique est le VRBL.

2.5. Interprétation des résultats

Limites recommandées de contamination microbiologique selon les BPF 2019.