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Unité 03 : Lecture interprétative de l’antibiogramme.

1- Apparition de la résistance
Les antibiotiques sont utilisés dans la lutte contre les infections bactériennes depuis la
découverte de la pénicilline en 1929 et des sulfamides en 1935. Les nouvelles molécules sont
d’abord utilisées en médecine humaine puis leur emploi est étendu à la médecine vétérinaire.
L’utilisation de ces antibiotiques s’accompagne inéluctablement de l’apparition de résistances
acquises depuis fort longtemps (très peu de temps après le début de l'antibiothérapie), par les
souches d’origine humaine ou animale, rendant l’efficacité des thérapeutiques plus aléatoire.
Actuellement, elle fait l'objet de publications et de revues nombreuses qui rendent compte de
sa constante évolution.

2- L’antibiogramme et ses intérêts

La résistance des bactéries aux antibiotiques est très variable et semble en augmentation, car
malheureusement certaines espèces bactériennes peuvent s'adapter plus rapidement aux
antibiotiques (résistance acquise) et donc, être classées en "inconstamment sensible" à tel ou
tel antibiotique, il est nécessaire d'effectuer au laboratoire, un antibiogramme.
2-1 :L’antibiogramme : C'est la détermination de la sensibilité d'une bactérie aux
antibiotiques. Terme contracté par analogie avec l'hémogramme. Examen quotidien de
laboratoire, en particulier hospitalier. Cet examen de routine va permettre de catégoriser la
souche à étudier en « Sensible », « Résistante » ou « Intermédiaire » en confrontant
la CMI d'un antibiotique donné à celle de la concentration cou C, proposée par le Comoté
d'experts, en France CA-SFM, Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de
Microbiologie).
2-2 : Intérêts de l’antibiogramme :

• Intérêt thérapeutique (individu): orientation des décisions thérapeutiques, adaptation de

l’antibiothérapie probabiliste.

• Mesurer la sensibilité d’une souche bactérienne à un ou plusieurs antibiotiques et dépister

les résistances acquises.

• Intérêt épidémiologique (collectif) –Suivi épidémiologique des résistances bactériennes.

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3- Facteurs influençant la résistance bactérienne

Les bactéries sont douées d’un pouvoir d’adaptation considérable, et chaque nouvelle pression
de sélection fait émerger de nouveaux mécanismes de résistance, contribuant à individualiser
de nouveaux phénotypes de résistances s’ajoutant aux préexistants. Ces mécanismes sont
transférables entre les souches de la même espèce bactérienne ou entre espèces différentes.
Cela peut se produire chez un même individu, entre homme et animal ou de l’environnement.

Le développement de l’antibiorésistance provient du fait même de l’utilisation des

antibiotiques mais certaines pratiques favorisent sa progression. C’est le cas de l’utilisation
des antibiotiques alors que ce n’est pas nécessaire (par exemple, lors d’affections virales non
surinfectées) ou de leur utilisation à des doses subefficaces (Pression antibiotique).

4- Méthodes de réalisation d’un antibiogramme

La mise en évidence de l'effet d'un antibiotique vis-à-vis d'une souche bactérienne est simple,
macroscopique et réalisable par plusieurs méthodes.

4-1 : La méthode de dilution en milieu liquide : Consiste à préparer une série de vue à
hémolyse avec le même milieu de culture liquide (2 ml) puis constituer une gamme de
concentrations de l'antibiotique à tester. Il reste un tube (contrôle) ou témoin de croissance de
la souche à tester. Enfin on ajoute la même quantité de germes dans chacun tube (inoculum).
La galerie ainsi préparée sera incubée à 37°C pendant 18 heures. Enfin elle sera examinée à
l'oeil nu.

Le principal inconvénient de cette méthode est la quantité de tubes à manipuler, soit 100 tubes
pour une dizaine d'antibiotiques à examiner. Une variante de cette méthode consiste à utiliser
des microcupules en plaque au lieu de tubes. Il s'agit d'une microméthode en milieu liquide.

Figure 01 : Résultats d’antibiogramme selon la méthode de dilution en milieu liquide.

4-2 : La méthode de dilution en milieu solide : Consiste à incorporer l'antibiotique à une

concentration donnée dans la gélose, maintenue liquide à 42°C. Une série de boites de Pétri
est préparée avec des concentrations d'antibiotique variant selon une progression géométrique

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de base de 2. Puis sont préparées les suspensions des différentes bactéries à examiner qui sont
alors distribuées dans les microcupules métalliques (exemple d'un système à 20 cupules).

Des tiges métalliques stériles plongent dans chaque cupule. Puis par un mouvement de
translation sont déposées les différentes bactéries sous le même volume (de l'ordre du
microlitre) à la surface du milieu gélosé ou solide. Après avoir ensemencé la série de boîtes,
celles-ci sont incubées à 37°C pdt 24h. La lecture est alors effectuée: il est facile de repérer
l'emplacement de chaque souche et de noter croissance ou absence de croissance.

Cette méthode semi-automatique est peu pratique. Car tester la sensibilité à 10 antibiotiques
nécessite de préparer une centaine de boîtes contenant les diverses concentrations
d'antibiotique.

Figure 02 : Résultats d’antibiogramme selon la méthode de dilution en milieu solide.

4-3 : La méthode de diffusion ou des disques en milieu solide : est la plus simple. Elle
consiste à ensemencer en surface d'un milieu solide par inondation de la souche à tester. Puis
à déposer des disques de papier buvard comprenant un antibiotique à une certaine
concentration. La boite ainsi préparée est mise à incuber pendant une nuit à 37°C. Il est
possible de voir la croissance bactérienne (au milieu de la boite) ainsi que des zones
d'inhibition de la croissance circulaires, à proximité de chaque disque.

Plus la zone d'inhibition est grande, plus grande est la sensibilité de la souche bactérienne
testée vis-à-vis de l'antibiotique étudié. Chaque zone peut être mesurée selon divers moyens:
règle, compas, pied à coulisse....La zone d'inhibition circulaire est mesurée par le diamètre en
mm, puis il sera possible de calculer la CMI de l'antibiotique pour la souche examinée en
reportant ce diamètre sur une courbe de concordance.

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Figure 03 : Résultats d’antibiogramme selon la méthode de dilution de disque.

4-4 : Autres méthodes :

• E-test : Un gradient de concentrations d'antibiotique est obtenu dans une bandelette

plastifiée. Il suffit de déposer l'une de celle-ci (une bandelette par antibiotique) à la
surface d'une boite de Pétri ensemencée par la suspension de la bactérie à tester puis après
un nuit d'incubation à 37°C dans une étuve, de lire directement la valeur de la CMI au
niveau de la zone à lire.

Figure 04 : Résultats d’une bandelette E-test.

• Semi-automates : Nouvelle génération d'automates, résultats en 6 -10 heures.

Figure 05 : Automates utilisés pour antibiogramme (Phoenix – Vitek).

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5- Rôle du microbiologiste
5-1 : Connaitre les résistance naturelle / acquise : La résistance naturelle ou intrinsèque
correspond à la capacité de résister à la présence d'un antibiotique pour toutes les souches
d'une espèce ou d'un genre bactérien. C’est L’expression d’un caractère inné, partagé par
l’ensemble de la communauté bactérienne, qui rend inappropriée l’utilisation de certains
antibiotiques. La Société Française de Microbiologie (SFM) définit la résistance naturelle
comme la caractéristique d’une espèce bactérienne qui se traduit par des concentrations
minimales inhibitrices (CMI) supérieures à la concentration critique supérieure des tests de
sensibilité pour l’antibiotique concerné. Habituellement le support de cette résistance est
chromosomique.

On oppose à la résistance naturelle, propriété d'espèce ou de genre, la résistance acquise qui

est une propriété de souche. Cette dernière correspond à la capacité de supporter une
concentration d'antibiotique beaucoup plus élevée que celle supportée par les autres souches
de la même espèce. Elle peut s'acquérir soit par mutation chromosomique, soit par acquisition
de matériels génétiques exogènes.

5-2 : Sélectionner les antibiotiques à tester : Le choix des antibiotiques à tester en routine
est fonction de nombreux facteurs tels que la bactérie identifiée, la disponibilité de
l'antibiotique et son utilisation possible chez l'hôte, etc. Il est important de faire appel aux
recommandations de la CA-SFM (ou EUCAST) qui propose pour chaque espèce ou groupe
bactérien :

• Antibiogramme standard (liste 1) : antibiotiques nécessaires à l’orientation thérapeutique,

en fonction des indications cliniques (type d’infection) et de la prévalence de la résistance
acquise.
• Tests complémentaires (liste 2) Intérêt épidémiologique, aptitude à détecter un mécanisme
de résistance ou antibiotique de recours.
5-3 : Lecture interprétative des résultats de l’antibiogramme : L’interprétation
phénotypique est une aide à la détection des résistances des bactéries isolées chez des patients, et
donc à l’identification des antibiotiques dont l’utilisation se solderait par un échec
thérapeutique. Mais rappelons que l’antibiogramme engage la responsabilité du biologiste déjà
par le simple fait de sa réalisation qui, lorsqu’elle est injustifiée, peut induire un traitement
inutile, voire dangereux. La nécessité de l’interprétation phénotypique d’un antibiogramme par
diffusion découle du constat qu’on ne peut pas se satisfaire de ce qui « apparaît » dans la boîte

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de Pétri, mais que ce n’est, au contraire, qu’une base de réflexion conduisant à des
informations sous-jacentes : on ne lit pas un antibiogramme, on l’interprète. Cette
interprétation commence dès lors que l’on décrète «S» à un antibiotique une bactérie pour laquelle le
diamètre d’inhibition (d) est > au diamètre critique, c’est-à-dire lorsque la CMI est < à la
concentration critique inférieure de l’antibiotique en question. Cependant, l’interprétation
phénotypique représente bien plus que cela. Elle est devenue possible puis incontournable grâce
aux progrès considérables de la connaissance des mécanismes biochimiques de résistance des
bactéries et des déterminismes génétiques impliqués.

5-3-1 : En fonction du prélèvement : Selon le type d’infection, la souche responsable et la

famille d’antibiotique étudiée, plusieurs recommandations sont proposées par la CA-SFM
et/ou l’EUCAST, il est alors indispensable aux microbiologistes de suivre les dernières
versions standards publiées par ceux-ci.

Exemples:

• «La charge des disques de cotrimoxazole n’étant pas adaptée, les souches isolées
d’infections urinaires et catégorisées sensible saux sulfamides et/ ou au triméthoprime
doivent être catégorisées sensibles à l’association triméthoprime-sulfaméthoxazole
(cotrimoxazole) » même si elles n’apparaissent pas sensibles CASFM 2018.
• « Alerter (sans modifier le résultat de l’antibiogramme) sur l’efficacité thérapeutique
incertaine des associations amoxicilline-clavulanate, ticarcilline-clavulanate et
pipéracilline-tazobactam dans le traitement des infections autres que les infections du
tractus urinaire si au moins une des céphalosporines de 3ème (céfotaxime,
ceftriaxone, ceftazidime) ou de 4ème génération (céfépime) n’est pas catégorisée
sensible (EUCAST expert rules v. 2.0, règle 9.1 de grade B) » CASFM 2018.

5-3-2 : en fonction du Test d’un antibiotique marqueur : La découverte de très nombreuses

enzymes d‘inactivation, mécanisme principal de la résistance aux antibiotiques, suivie de
l’élucidation de leur structure et de leur purification a permis d’en établir avec précision leur «
spectre de substrat » in vitro, en d’autres termes le panel d’antibiotiques qu’elles sont capables
d‘hydrolyser in vitro, plus ou moins fortement, selon la sensibilité de la molécule à l’enzyme.
Dès lors, leur détection chez une bactérie pathogène se fera grâce à l’utilisation dans
l’antibiogramme de la molécule la plus sensible du panel (marqueur de R), permettant ainsi
d’inférer la résistance aux autres molécules de ce panel, sans avoir à les tester (résistance

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croisée). Leur mode de production, constitutive ou inductible, a permis de mettre au point des
tests de facilitation de détection par le placement judicieux des disques d’antibiotiques sur la
gélose (inhibiteurs de bêta-lactamases et C3G ou C4G, érythromycine-clindamycine…).

• Antibiotique qui peut induire des résistances croisées à la même famille d’antibiotiques
Exemple : Une souche d’entérobactérie : Si S à l’amoxicilline : donc S à toutes les Bêta-
lactamines./ Si S à l’acide nalidixique : donc S à tous les quinolones.

• Antibiotique qui peut induire des résistances associées à d’autres familles d’antibiotiques
Exemple : Haemophilus : Dans 90 % des cas, la résistance à la kanamycine est associée à la
production de bêta-lactamase.

5-3-3 : Les synergies et Les antagonismes : Prescrire un antibiogramme est un acte

quotidien et banal qui va rechercher à confirmer la sensibilité d'une bactérie à un antibiotique
donné. Néanmoins cet examen routinier n'explore pas les interactions entre deux, voire trois
antibiotiques sauf circonstances particulières.

D'autres méthodes permettent de préciser d'autres paramètres d'une antibiothérapie adaptée

comme de calculer les effets synergiques de deux antibiotiques tel l'effet bactériostatique et
bactéricide d'une assocation de deux antibiotiques.

Exemples :
• La présence d’une BLSE peut être confirmée par l’utilisation de la méthode de la synergie
entre deux disques sur l’antibiogramme standard c’est à dire un disque de céfotaxime,
ceftazidime ou céfépime et un disque contenant de l’acide clavulanique (ex. amoxilline +
ac. clavulanique : AMC) distants de 30 mm des disques de céphalosporine. La présence
d’une BLSE s’exprime par l’apparition d’une synergie en « bouchon de champagne ».
CA-SFM 2014.

Figure 06 : Résistances aux béta-lactamines: (Synergie entre AMP/AC et C3G).

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• La résistance inductible à la clindamycine ne peut être détectée qu'en présence d'un

macrolide. Elle est mise en évidence sur l'antibiogramme par une image d'antagonisme
entre la clindamycine et l'érythomycine.

Figure 07 : Résistances aux macrolides : Staphylocoque.

5-3-4 : Réalisation de tests complémentaires : Certaines épreuves complémentaires

permettent d’affiner l’interprétation phénotypique. La liste de ces tests complémentaires est
longue, à commencer par le « vieux » test à la céfinase, céphalosporine chromogène, permettant
la détection de la pénicillinase du staphylocoque, d’Haemophilus sp. et autres, jusqu’aux tests
moléculaires pour la détection des gènes de résistance des entérocoques aux glycopeptides ou des
gènes codant pour différentes carbapénèmases. Les disques combinant antibiotiques et
inhibiteurs, les bandelettes à gradient de concentration d’antibiotiques elles-mêmes
combinées aux inhibiteurs, le test de Hodges modifié, et les mesures de CMI elles-mêmes
participent de l’interprétation phénotypique.

Exemple :

Figue 08 : Recherche de carbapenémases : test de Hodges.

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5-3-5 : Modification de catégorisation : La lecture interprétative évolue également en

fonction des règles régissant les résistances associées. L’exemple le plus récent à ce jour, et
certainement le plus déstabilisant pour le microbiologiste et plus encore pour le clinicien, est
l’abandon par le CA-SFM et son équivalent européen (EUCAST) de la règle d’interprétation
accompagnant la présence d’une BLSE et obligeant, en présence de cette BLSE, à considérer
comme « I » ou « R » toutes les C3G, C4G, aztréonam, quand bien même le diamètre
d’inhibition sur l’antibiogramme par diffusion est > au diamètre critique. A présent
considérer comme plausible qu’une entérobactérie puisse être céfotaxime (CTX) « R » et
ceftazidime (CAZ) « S »,ou CTX/CAZ « R » mais céfépime « S », est à mettre au crédit des
avancées considérables de la pharmacodynamie des antibiotiques.

Exemple :

• « Si l’isolat clinique est catégorisé «intermédiaire» à la gentamicine et «sensible» aux

autres aminosides, catégoriser l’isolat «résistant» à la gentamicine (EUCAST expert rule
v.2.0, règle 12.8) . L’expression de l’enzyme AAC(3)-I peut être faible, et des isolats
bactériens pourraient donc avoir une sensibilité diminuée à la gentamicine » CASFM
2018 -Règles de lecture interprétative : Aminosides et entérobactéries.
• « Catégoriser «intermédiaire» l’isolat clinique catégorisé «sensible» à la pipéracilline
alors qu’il est catégorisé «résistant» ou «intermédiaire» à la ticarcilline (EUCAST expert
rules v. 2.0, règle 9.3 de grade C). Les β-lactamases hydrolysant la ticarcilline
hydrolysent également la pipéracilline, mais la résistance peut être moins évidente si
l’expression de la β-lactamase est faible (principalement observée chez Klebsiella spp. et
E. coli). Cette règle ne s’applique pas aux associations pénicillines-inhibiteursde β-
lactamases » CASFM 2018 -Règles de lecture interprétative : β-lactamines et
entérobactéries.

5-4 : Validation d’identification et déduction du mécanisme de résistance : Pour chaque

famille d’antibiotiques, on observe le résultat brut in vitro obtenu pour un certain nombre de
molécules judicieusement choisies (il n’est bien sûr pas possible de tester toutes les bêta-
lactamines par exemple). On obtient ainsi un phénotype de résistance, « observé », avec le quel
on pourra soit confirmer ou corriger les résultats d’identification (Résistance naturelle de tel
souche à un tel antibiotique). De ce phénotype de résistance, on déduit également un
mécanisme biochimique de résistance (attention aux associations de mécanismes dont sont

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capables les bactéries et qui compliquent parfois singulièrement cette étape). Une fois le
mécanisme élucidé, on en déduit toutes les résistances croisées pour établir le panel de l’ensemble
des molécules concernées par le mécanisme de résistance incriminé. On mesure là toute
l’importance de la lecture interprétative.

5-5 : Dialogue biologiste-clinicien : Cet affinement de la lecture interprétative par le

microbiologiste devrait, attirer l’attention du clinicien et l’aider à faire un bon choix
d’antibiothérapie et d’isolement de patients à risque, ce qui va, espérons-le, contribuer à
optimiser les traitements des infections à bactéries multirésistantes (diminution de l’utilisation
des carbapénèmes, recul de l’utilisation de posologies trop importantes de vancomycine….).

À l’évidence, l’interprétation phénotypique ou lecture interprétative de l’antibiogramme est en

perpétuelle évolution. Cela est tant mieux, car nous prendrions un grand risque à rester figés,
attentistes, face à l’adaptation incessante et très efficace des bactéries que nous stressons avec
les antibiotiques.
Exemples d’interprétation d’antibiogramme :

✓ Famille bactérienne : Les entérobactéries.

✓ Méthode de réalisation : Diffusion en disque sur milieu gélosé (gélose MH).
✓ Famille d’antibiotique : b-lactamines.
✓ Caractères recherchés : Dépistage des phénotypes de résistance.
Tab.01 : Résistance naturelle des entérobactéries (CASFM2018).

R : résistance naturelle ; AM : aminopénicillines ; AMC : amoxicilline + acide clavulanique ; TIC : ticarcilline ;

PIP : pipéracilline ; C1G : céphalosporines de 1ère génération ; FOX : céfoxitine ; MA : céfamandole ; CXM :
céfuroxime ; GM : gentamicine ; TET : tétracyclines y compris la tigécycline ; COL : colistine, polymyxine B ;
FT : nitrofuranes.

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Pénicillinases : pénicillinase à bas niveau enzyme produite naturellement chez quelques

espèces, et sont de ce fait résistantes aux aminopénicillines, aux carboxypénicillines et, à
moindre degré, aux uréidopénicillines. Une inhibition de l’activité enzymatique par l’acide
clavulanique (activité de AMC et TCC > AMX et TIC) est également observée. Des
pénicillinases acquises peuvent être détectées parmi l’ensemble des entérobactéries. La
Pénicillinase peut être produite à haut niveau, et excepter la résistance haut niveau à AMC et
TCC (pas d’activité d’inhibition de l’acide clavulanique).

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BLSE : bétalactamases à spectre étendu : sont des enzymes qui hydrolysent aussi bien les
pénicillines que les oxyiminocéphalosporines (ceftriaxone, céfotaxime, ceftazidime…) et les
monobactames (aztréonam). Les céphamycines (céfoxitine, céfotétan, latamoxef) et les
carbapénèmes (imipénème, ertapénème, méropénème et doripénème) restent actifs, alors que
les activités des C4G (céfépime, cefpirome) et celles des associations β-lactamines/
inhibiteurs classiques de bêtalactamases (amoxicilline ou ticarcilline associé à l’acide
clavulanique, ou encore pipéracilline associé au tazobactam) sont variables. Une image de
synergie (inhibition de l’activité enzymatique par l’acide clavulanique) est souvent détectée
entre les C3G et AMC ou TCC.

Le plus souvent d’origine plasmidique (gènes de résistance aux autres molécules). Différents
types (plus de 200 BLSE décrites) : – TEM – SHV – CTX-M

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Céphalosporinases : enzymes produites naturellement à bas niveau (chromosomique non

inductible) qui peut conférer une sensibilité réduite aux aminopénicillines, associées ou non à
l’acide clavulanique, et/ou aux C1G. Chez certaines souches appartenant au groupe 3 des
entérobactéries, une hyperproduction constitutive peut être observée. Ce qui contribue à
rendre ces souches résistantes à l’aztréonam, aux céphamycines et aux C3G. Les C4G restent
en général actives. Le phénotype « céphalosporinase de haut niveau » peut aussi avoir un
support plasmidique. Lorsque le niveau d’expression de l’enzyme est trop élevé, l’image de
synergie est plus difficile à mettre en évidence.

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Carbapénémases : enzymes, qui inactivent un grand nombre de β-lactamines, et notamment

les carbapénèmes (Ertapénéme, Imipénéme), ont cependant un spectre d’hydrolyse variable
selon le type d’enzyme.

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