PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 9.0 2.6.13.

Recherche de microorganismes spécifiés

04/2010:20613 – Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhimurium :

par exemple ATCC 14028 ; ou Salmonella enterica subsp.
enterica sérovar Abony : par exemple NBRC 100797,
NCTC 6017, CIP 80.39 ;
– Candida albicans : par exemple ATCC 10231, NCPF 3179,
2.6.13. CONTRÔLE IP 48.72, NBRC 1594.
MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS Utilisez de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium
NON STÉRILES : RECHERCHE DE pH 7,0 ou de la solution tampon phosphate pH 7,2 pour
MICROORGANISMES SPÉCIFIÉS(3) préparer des suspensions témoins. Utilisez les suspensions
dans les 2 h ou dans les 24 h si elles sont conservées à 2-8 °C.
1. INTRODUCTION 3-1-2. Clostridies. Utilisez une souche de Clostridium
Les essais décrits ci-après permettent de contrôler l’absence, sporogenes, par exemple ATCC 11437 (NBRC 14293,
ou la présence limitée, de microorganismes spécifiés pouvant NCIMB 12343, CIP 100651) ou ATCC 19404 (NCTC 532
être décelés dans les conditions décrites. ou CIP 79.03). Cultivez la souche clostridienne de référence
dans des conditions anaérobies dans du milieu renforcé pour
Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si clostridies à 30-35 °C pendant 24-48 h. On peut également,
une substance ou préparation satisfait à une spécification plutôt que de préparer puis diluer une suspension fraîche de
préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient cellules végétatives de Cl. sporogenes, utiliser pour l’inoculation
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après, une suspension de spores stable. Cette suspension peut être
notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à maintenue à 2-8 °C pendant une durée validée.
prélever et l’interprétation des résultats.
3-2. TÉMOIN NÉGATIF
D’autres méthodes microbiologiques, notamment des
méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition Pour vérifier les conditions opératoires, effectuez un contrôle
que leur équivalence avec la méthode de la pharmacopée ait sur un témoin négatif préparé en substituant le diluant choisi
été démontrée. à la préparation à examiner. Aucune croissance microbienne
n’est observée. Un contrôle sur un témoin négatif est
2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES également effectué lors de l’examen du produit comme décrit
dans la section 4. L’obtention d’un résultat non conforme
Préparez les échantillons comme décrit dans le chapitre 2.6.12. nécessite une investigation.
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne,
3-3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée comme
MILIEUX
décrit dans le chapitre 2.6.12.
Effectuez ce contrôle sur chaque lot de milieu, qu’il soit acheté
Si des substances tensioactives sont utilisées pour la prêt à l’emploi ou préparé à partir d’un milieu déshydraté ou
préparation des échantillons, leur absence de toxicité à l’égard des ingrédients décrits.
des microorganismes considérés et leur compatibilité avec les Vérifiez que les milieux concernés présentent les propriétés
neutralisants utilisés doivent être démontrées comme décrit voulues (voir tableau 2.6.13.-1).
dans le chapitre 2.6.12.
Contrôle de la fertilité, milieux liquides : ensemencez un
3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES échantillon du milieu approprié avec une petite quantité (au
MILIEUX, APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI ET maximum 100 UFC) du microorganisme approprié. Incubez à
TÉMOINS NÉGATIFS la température spécifiée pendant une durée inférieure ou égale
L’aptitude de l’essai à permettre la détection des à la durée minimale spécifiée pour l’essai. Une croissance
microorganismes en présence du produit à examiner doit clairement visible du microorganisme, comparable à celle
être établie. L’applicabilité de la méthode d’essai doit être obtenue sur un lot de milieu précédemment contrôlé et
confirmée chaque fois qu’un changement susceptible d’affecter approuvé, est observée.
le résultat de l’essai est apporté au mode opératoire ou au
Contrôle de la fertilité, milieux solides : opérez par la méthode
produit.
d’ensemencement en surface, en ensemençant chaque
3-1. PRÉPARATION DES SOUCHES DE RÉFÉRENCE plaque avec une petite quantité (au maximum 100 UFC) du
Utilisez des suspensions standardisées stables des souches microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée
de référence ou préparez des suspensions comme indiqué pendant une durée inférieure ou égale à la durée minimale
ci-après. Les cultures sont effectuées selon un système de lot spécifiée pour l’essai. Une croissance du microorganisme
de semence tel que les microorganismes viables utilisés pour comparable à celle obtenue sur un lot de milieu précédemment
l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir du lot contrôlé et approuvé est observée.
de semence primaire d’origine.
Contrôle des propriétés inhibitrices, milieux liquides ou solides :
3-1-1. Microorganismes aérobies. Cultivez séparément ensemencez le milieu approprié avec au moins 100 UFC du
chacune des souches bactériennes de référence dans du milieu microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée
liquide aux peptones de caséine et de soja ou sur du milieu pendant une durée égale ou supérieure à la durée maximale
gélosé aux peptones de caséine et de soja, à 30-35 °C pendant spécifiée pour l’essai. Aucune croissance du microorganisme
18-24 h, et la souche de référence de Candida albicans sur du n’est observée.
milieu Sabouraud dextrosé-gélosé ou dans du milieu liquide
Sabouraud dextrosé, à 20-25 °C pendant 2-3 jours. Contrôle des propriétés indicatives : opérez par la méthode
– Staphylococcus aureus : par exemple ATCC 6538, d’ensemencement en surface, en ensemençant chaque
NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 ; plaque avec une petite quantité (au maximum 100 UFC) du
microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée
– Pseudomonas aeruginosa : par exemple ATCC 9027, pendant une durée comprise dans l’intervalle spécifié pour
NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 ; l’essai. Les colonies sont comparables, quant à leur aspect et
– Escherichia coli : par exemple ATCC 8739, NCIMB 8545, aux réactions indicatives observées, à celles obtenues sur un
CIP 53.126, NBRC 3972 ; lot de milieu précédemment contrôlé et approuvé.
(3) Ce chapitre a fait l’objet du processus d’harmonisation des pharmacopées. Voir chapitre 5.8. Harmonisation des pharmacopées.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 213
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 9.0

Tableau 2.6.13.-1. – Fertilité, propriétés inhibitrices et propriétés indicatives des milieux

Milieu Propriétés Microorganisme de référence
Recherche des bactéries gram-négatives Milieu d’enrichissement pour les Fertilité E. coli
résistantes aux sels biliaires entérobactéries Mossel P. aeruginosa
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé à la bile-violet-rouge Fertilité + indication E. coli

avec glucose P. aeruginosa
Recherche d’Escherichia coli Milieu liquide de MacConkey Fertilité E. coli
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé de MacConkey Fertilité + indication E. coli

Recherche des salmonelles Milieu liquide d’enrichissement pour Fertilité Salmonella enterica subsp. enterica
les salmonelles Rappaport-Vassiliadis sérovar Typhimurium ou Salmonella
enterica subsp. enterica sérovar Abony
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé xylose-lysine- Fertilité + indication Salmonella enterica subsp. enterica

désoxycholate sérovar Typhimurium ou Salmonella
enterica subsp. enterica sérovar Abony
Recherche de Pseudomonas aeruginosa Milieu gélosé-cétrimide Fertilité P. aeruginosa

Inhibition E. coli
Recherche de Staphylococcus aureus Milieu gélosé mannitol-sel Fertilité + indication S. aureus

Inhibition E. coli
Recherche des clostridies Milieu renforcé pour clostridies Fertilité Cl. sporogenes
Gélose Columbia Fertilité Cl. sporogenes
Recherche de Candida albicans Milieu liquide Sabouraud dextrosé Fertilité C. albicans
Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé Fertilité + indication C. albicans

3-4. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI 30-35 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu gélosé à la
Pour chaque produit à examiner, procédez à la préparation bile-violet-rouge avec glucose et incubez 30-35 °C pendant
de l’échantillon comme décrit dans le paragraphe approprié 18-24 h.
de la section 4. Ajoutez chaque souche de référence au Le produit satisfait à l’essai s’il n’est pas observé de croissance
moment du mélange, dans le milieu prescrit. Effectuez de colonies.
l’essai individuellement avec chaque souche de référence. 4-1-3. Essai quantitatif
Utilisez un nombre de microorganismes équivalant, au
maximum, à 100 UFC dans la préparation à examiner après 4-1-3-1. Sélection et subculture. Ensemencez des
ensemencement. quantités appropriées de milieu d’enrichissement pour les
entérobactéries-Mossel avec la préparation décrite sous
Effectuez l’essai comme décrit dans le paragraphe approprié de 4-1-1 et/ou des dilutions de cette préparation contenant
la section 4, en incubant pendant la durée minimale prescrite. respectivement 0,1 g, 0,01 g et 0,001 g (ou 0,1 mL, 0,01 mL et
Les réactions indicatives décrites dans la section 4 doivent 0,001 mL) du produit à examiner. Incubez à 30-35 °C pendant
montrer la présence des microorganismes spécifiés. 24-48 h. Repiquez chacune des cultures sur du milieu gélosé à
la bile-violet-rouge avec glucose. Incubez à 30-35 °C pendant
Si le produit présente une activité antimicrobienne, il faut 18-24 h.
apporter les modifications voulues à la procédure d’essai (voir 4-1-3-2. Interprétation. La croissance de colonies constitue un
chapitre 2.6.12, paragraphe 4-5-3). résultat positif. Notez la plus petite quantité de produit qui
S’il s’avère impossible de neutraliser l’activité antimicrobienne donne un résultat positif et la plus grande quantité de produit
exercée par un produit donné sur un microorganisme dont la qui donne un résultat négatif. Déterminez le nombre probable
recherche est prescrite, ce microorganisme sera présumé ne de bactéries à l’aide du tableau 2.6.13.-2.
plus être présent dans le produit. Tableau 2.6.13.-2. – Interprétation des résultats
Résultats obtenus avec une quantité de produit de Nombre
probable de
4. CONTRÔLE DES PRODUITS bactéries par
0,1 g ou 0,01 g ou 0,001 g ou gramme ou
4-1. BACTÉRIES GRAM-NÉGATIVES RÉSISTANTES AUX 0,1 mL 0,01 mL 0,001 mL millilitre de
SELS BILIAIRES produit
+ + + > 103
4-1-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre + + − < 103 et > 102
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
+ − − < 102 et > 10
produit à examiner, mais avec comme diluant du milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja. Mélangez, puis − − − < 10
incubez à 20-25 °C pendant un temps suffisant pour assurer la
revivification des bactéries, mais insuffisant pour permettre 4-2. ESCHERICHIA COLI
leur multiplication (généralement 2 h mais pas plus de 5 h). 4-2-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
4-1-2. Absence de ces bactéries. Sauf indication contraire, Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre 2.6.12,
utilisez le volume d’inoculum correspondant à 1 g du produit, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du produit à
préparé comme décrit sous 4-1-1, pour ensemencer du milieu examiner, et ensemencez une quantité appropriée (déterminée
d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel. Incubez à comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux peptones de

214 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 9.0
caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon ou la quantité
correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez, puis
incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
4-2-2. Sélection et subculture. Agitez le récipient, puis
transférez 1 mL du milieu liquide aux peptones de caséine
et de soja dans 100 mL de milieu liquide de MacConkey et
incubez à 42-44 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu
gélosé de MacConkey et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
4-2-3. Interprétation. La croissance de colonies indique
la présence possible d’E. coli, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
l’identification sont négatifs.
4-3. SALMONELLES
4-3-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez le produit à examiner comme décrit dans le
chapitre 2.6.12 et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja avec une quantité d’échantillon
correspondant à au moins 10 g ou 10 mL de produit.
Mélangez, puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
4-3-2. Sélection et subculture. Transférez 0,1 mL du milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja dans 10 mL
de milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
Rappaport-Vassiliadis et incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
Repiquez sur du milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate et
incubez à 30-35 °C pendant 18-48 h.
4-3-3. Interprétation. La croissance de colonies rouges
bien développées, avec ou sans centre noir, indique la
présence possible de salmonelles, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
4-4-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre 2.6.12,
en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du produit à
examiner, et ensemencez une quantité appropriée (déterminée
comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux peptones de
caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon ou la quantité
correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez. Pour
les dispositifs transdermiques, filtrez sur une membrane
stérile le volume d’échantillon correspondant à 1 dispositif,
préparé comme décrit dans le paragraphe 4-5-1 du chapitre
2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 mL de milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez à 30-35 °C
pendant 18-24 h.
4-4-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
gélosé-cétrimide et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
4-4-3. Interprétation. La croissance de colonies indique la
présence possible de P. aeruginosa, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
l’identification sont négatifs.
4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
4-5-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre 2.6.12,
en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du produit à
examiner, et ensemencez une quantité appropriée (déterminée
comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux peptones de
caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon ou la quantité
correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez. Pour
les dispositifs transdermiques, filtrez sur une membrane
stérile le volume d’échantillon correspondant à 1 dispositif,
Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés
préparé comme décrit dans le paragraphe 4-5-1 du chapitre
2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 mL de milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez à 30-35 °C
pendant 18-24 h.
4-5-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu gélosé
mannitol-sel et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
4-5-3. Interprétation. La croissance de colonies
jaunes/blanches entourées d’une zone jaune indique la
présence possible de S. aureus, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
4-6. CLOSTRIDIES
4-6-1. Préparation de l’échantillon et traitement à la
chaleur. Préparez un échantillon comme décrit dans le
chapitre 2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 (avec un
volume total minimal de 20 mL) d’au moins 2 g ou 2 mL du
produit à examiner. Divisez l’échantillon en 2 fractions d’au
moins 10 mL. Chauffez l’une d’elles à 80 °C pendant 10 min,
puis refroidissez rapidement. Ne chauffez pas l’autre.
4-6-2. Sélection et subculture. Ensemencez une quantité
appropriée (déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu
renforcé pour clostridies avec 10 mL de chacune des fractions,
ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 mL de produit.
Incubez en anaérobiose à 30-35 °C pendant 48 h. Après
incubation, effectuez à partir de chaque récipient un repiquage
sur de la gélose Columbia, puis incubez en anaérobiose à
30-35 °C pendant 48-72 h.
4-6-3. Interprétation. La croissance anaérobie de bâtonnets
(avec ou sans endospores) donnant une réaction catalase
négative indique la présence de clostridies, à confirmer par
des essais d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
4-7. CANDIDA ALBICANS
4-7-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez le produit à examiner comme décrit dans le
chapitre 2.6.12 et ensemencez 100 mL de milieu liquide
Sabouraud dextrosé avec 10 mL d’échantillon ou la quantité
correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez, puis
incubez à 30-35 °C pendant 3-5 jours.
4-7-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
Sabouraud dextrosé-gélosé et incubez à 30-35 °C pendant
24-48 h.
4-7-3. Interprétation. La croissance de colonies blanches
indique la présence possible de C. albicans, à confirmer par
des essais d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
La section suivante est donnée à titre d’information.
5. SOLUTIONS ET MILIEUX DE CULTURE
RECOMMANDÉS
Les solutions et milieux de culture suivants se sont avérés
satisfaisants pour la réalisation des essais de contamination
microbienne prescrits dans la Pharmacopée. D’autres milieux
peuvent être utilisés dès lors que leur applicabilité peut être
démontrée.
Solution tampon mère. Transférez 34 g de phosphate
monopotassique dans une fiole jaugée de 1000 mL, dissolvez
dans 500 mL d’eau purifiée, ajustez à pH 7,2 ± 0,2 avec de
l’hydroxyde de sodium, complétez à 1000.0 mL avec de l’eau
purifiée et mélangez. Répartissez en récipients et stérilisez.
Conservez à une température de 2-8 °C.
215
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 9.0

Solution tampon phosphate pH 7,2. Préparez un mélange Phosphate monopotassique 2,0 g

de solution tampon mère et d’eau purifiée (1:800 V/V) et Phosphate disodique dihydraté 8,0 g
stérilisez.
15 mg
Solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH 7,0 Vert brillant

Phosphate monopotassique 3,6 g Eau purifiée 1000 mL

Phosphate disodique dihydraté 7,2 g équivalant à 0,067 M de Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après
phosphate
chauffage. Chauffez à 100 °C pendant 30 min et refroidissez
Chlorure de sodium 4,3 g immédiatement.
Peptone de viande ou de caséine 1,0 g Milieu gélosé à la bile-violet-rouge avec glucose
Eau purifiée 1000 mL Extrait de levure 3,0 g

Hydrolysat pancréatique de gélatine 7,0 g

Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Sels biliaires 1,5 g
Milieu liquide aux peptones de caséine et de soja
Peptone pancréatique de caséine 17,0 g Chlorure de sodium 5,0 g

Peptone papaïque de soja 3,0 g Glucose monohydraté 10,0 g

Chlorure de sodium 5,0 g Gélose 15,0 g

Phosphate dipotassique 2,5 g Rouge neutre 30 mg

Glucose monohydraté 2,5 g Violet cristallisé 2 mg

Eau purifiée 1000 mL

Eau purifiée 1000 mL

Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. chauffage. Chauffez à ébullition ; ne chauffez pas en autoclave.
Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja Milieu liquide de MacConkey
Hydrolysat pancréatique de gélatine 20,0 g
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Lactose monohydraté 10,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Bile de boeuf déshydratée 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Pourpre de bromocrésol 10 mg
Gélose 15,0 g
Eau purifiée 1000 mL
Eau purifiée 1000 mL
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Milieu gélosé de MacConkey
Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé
Hydrolysat pancréatique de gélatine 17,0 g
Dextrose 40,0 g
Peptones de viande et de caséine 3,0 g
Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g
peptone pancréatique de caséine (1:1) Lactose monohydraté 10,0 g
Gélose 15,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Eau purifiée 1000 mL
Sels biliaires 1,5 g
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après Gélose 13,5 g
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Rouge neutre 30,0 mg
Milieu dextrosé-gélosé à la pomme de terre
Infusion de pomme de terre 200 g Violet cristallisé 1 mg

Dextrose 20,0 g Eau purifiée 1000 mL

Gélose 15,0 g Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,1 ± 0,2 à 25 °C après

stérilisation. Portez à ébullition pendant 1 min en agitant
Eau purifiée 1000 mL
constamment, puis stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après Milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Rappaport-Vassiliadis
Milieu liquide Sabouraud dextrosé Peptone de soja 4,5 g
Dextrose 20,0 g Chlorure de magnésium hexahydraté 29,0 g

Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g Chlorure de sodium 8,0 g

peptone pancréatique de caséine (1:1)
1000 mL Phosphate dipotassique 0,4 g
Eau purifiée
Phosphate monopotassique 0,6 g
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Vert malachite 0,036 g

Milieu d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel Eau purifiée 1000 mL

Hydrolysat pancréatique de gélatine 10,0 g
Dissolvez en chauffant doucement. Stérilisez à l’autoclave
Glucose monohydraté 5,0 g selon un cycle validé, à une température ne dépassant pas
Bile de boeuf déshydratée 20,0 g 115 °C. Le pH doit être de 5,2 ± 0,2 à 25 °C après chauffage
et passage à l’autoclave.

216 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 9.0 2.6.14. Essai des endotoxines bactériennes

Milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition sous
Xylose 3,5 g agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour qu’il soit
de 6,8 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez à l’autoclave
L-Lysine 5,0 g selon un cycle validé.
Lactose monohydraté 7,5 g Gélose Columbia
Saccharose 7,5 g Peptone pancréatique de caséine 10,0 g

Chlorure de sodium 5,0 g Peptone peptique de viande 5,0 g

Extrait de levure 3,0 g Peptone pancréatique de coeur 3,0 g

Rouge de phénol 80 mg Extrait de levure 5,0 g

Gélose 13,5 g Amidon de maïs 1,0 g

Désoxycholate sodique 2,5 g Chlorure de sodium 5,0 g

Thiosulfate de sodium 6,8 g Gélose, selon pouvoir gélifiant 10,0-15,0 g

Citrate ferrique et d’ammonium 0,8 g Eau purifiée 1000 mL

Eau purifiée 1000 mL Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition

Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après
chauffage. Chauffez à ébullition, refroidissez à 50 °C et
répartissez en boîtes de Pétri. Ne chauffez pas en autoclave.
Milieu gélosé-cétrimide
Hydrolysat pancréatique de gélatine
sous agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour
qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez à
l’autoclave selon un cycle validé. Laissez refroidir à 45-50 °C ;
ajoutez si nécessaire une quantité de sulfate de gentamicine
correspondant à 20 mg de gentamicine base et répartissez en
boîtes de Pétri.
20,0 g

Chlorure de magnésium 1,4 g

01/2010:20614
Sulfate dipotassique 10,0 g corrigé 7.0
Cétrimide 0,3 g

Gélose 13,6 g

Eau purifiée 1000 mL

Glycérol 10,0 mL
2.6.14. ESSAI DES ENDOTOXINES
BACTÉRIENNES
Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le pH L’essai des endotoxines bactériennes (EEB) est destiné à la
pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez détection ou la quantification des endotoxines produites
à l’autoclave selon un cycle validé. par des bactéries gram-négatives, au moyen d’un lysat
d’amoebocytes de limule (Limulus polyphemus ou Tachypleus
Milieu gélosé mannitol-sel tridentatus). Il peut être réalisé par 3 techniques : gélification
Peptone pancréatique de caséine 5,0 g (induction de la formation d’un gel), turbidimétrie
Peptone peptique de tissu animal 5,0 g
(développement d’une turbidité par clivage d’un substrat
endogène), colorimétrie (développement d’une coloration par
Extrait de viande de boeuf 1,0 g clivage d’un complexe peptide-chromogène synthétique).
D-Mannitol 10,0 g 6 méthodes sont décrites dans le présent chapitre :
Chlorure de sodium 75,0 g Méthode A. Gélification : essai limite.
Gélose 15,0 g Méthode B. Gélification : essai semi-quantitatif.
Rouge de phénol 0,025 g Méthode C. Turbidimétrie cinétique.
Eau purifiée 1000 mL Méthode D. Colorimétrie cinétique.
Méthode E. Colorimétrie en point final.
Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le pH
pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez Méthode F. Turbidimétrie en point final.
à l’autoclave selon un cycle validé.
Effectuez l’essai par l’une des 6 méthodes décrites. En cas de
Milieu renforcé pour clostridies doute ou de litige, la décision finale est prise sur la base des
Extrait de viande de boeuf 10,0 g résultats obtenus par la méthode A, sauf indication contraire
dans la monographie.
Peptone 10,0 g
L’essai est effectué dans des conditions permettant d’éviter
Extrait de levure 3,0 g toute contamination par des endotoxines.

Amidon soluble 1,0 g

1. APPAREILLAGE
Glucose monohydraté 5,0 g Dépyrogénez dans un four à air chaud, par une méthode
Chlorhydrate de cystéine 0,5 g validée, toute la verrerie et les autres éléments d’appareillage
résistant à la chaleur. La durée et la température minimales
Chlorure de sodium 5,0 g de chauffage sont généralement de 30 min à 250 °C. Si de
Acétate de sodium 3,0 g l’appareillage en plastique est utilisé (par exemple des plaques
de microtitrage ou des pointes de pipette pour distributeurs
Gélose 0,5 g automatiques), l’absence de contamination détectable par des
Eau purifiée 1000 mL endotoxines et l’absence d’interférence de ce matériel dans
l’essai doit être établie.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 217