Méthodes de

détection
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Volume I
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Méthodes de détection pour la flash et la prep HPLC

Lors des séparations par chromatographie, il est essentiel de déterminer le moment précis
de la migration des composants de la colonne ou de la cartouche afin d’obtenir le meilleur
fractionnement. Un détecteur de chromatographie est un capteur conçu pour identifier la
présence des composants lorsqu’ils sont élués de la colonne ou de la cartouche. Le détecteur
analyse les variations des taux des composants et les transforme en un signal électrique qui
est enregistré par le système de données.
Dans la chromatographie préparative liquide, les détecteurs doivent concilier les débits élevés
et des fortes concentrations de produit inhérents au process. Il existe plusieurs types de
détecteurs et chaque détecteur possède des avantages spécifiques ainsi que des limitations.
Nous allons étudier plus en détails les cinq types de détecteurs utilisés dans la chromato-
graphie liquide.

Détecteur UV

Les détecteurs UV sont le plus souvent utilisés dans la chromatographie préparative. Un détec-
teur UV est un détecteur sélectif, ce qu’il signifie qu’il est capable de mesurer uniquement des
substances qui absorbent la lumière sur une longueur d’onde dans la gamme des ultraviolettes
(200-400 nm) ou dans la gamme visible (400-800 nm). Les substances compatibles avec la
détection UV comprennent des composants avec un groupe chromophore tels que

• Cycle aromatique
• Double liaison conjuguée
• Double liaison adjacente à un atome avec une paire d’électrons
• Groupe carbonyle
• Brome, iode ou soufre

Le détecteur UV mesure le changement d’intensité d’un faisceau UV traversant une solution.

L’absorption de la lumière est liée à la concentration de la solution que traverse le faisceau. Cette
théorie est illustrée par la loi Lambert-Beer :

E = Extinction [sans dimension]

ε = Coefficient d’extinction [M–1· cm–1]
c = Solution concentration [mol/l]
d = longueur de la cuve contenant solution [cm]

Chaque solvant possède un seuil d’absorbance pour une longueur d’ondes spécifique. Pour
des longueurs d’ondes en-dessous de ce seuil, le solvant absorbe toute la lumière. Lorsque
vous utilisez un détecteur UV, il est nécessaire de choisir un solvant qui n’a pas d’absorption
significative pour la longueur d’ondes sur laquelle des mesures seront prises. Autrement, les sig-
naux de la substance et du solvant vont s’entrecroiser et indiquer un fractionnement incorrect.

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Les solvants critiques typiques utilisés sont l’acétone, le toluène et le benzène, comme indiqué
dans le tableau ci-après :

Seuil limite UV Seuil limite UV

Solvant Solvant
(nm) (nm)

Acétone 330 Dipropylether 220

Toluéne 285 Héxane 210

Benzène 285 Cyclohéxane 210

N,N- Ethanol 210

275
Dimethylformamide
Méthanol 210
Dimethyl sulfoxide 275
Propanol 210
Ethyl acétate 260
Heptane 200
Dichlorométhane 245
Acétonitrile 200
Chloroforme 245
Eau 190
Dichloroéthane 230

Tetrahydrofurane 220

Table 1: Solvants critiques utilisés en chromatographie flash et prep HPLC

Si le spectre d’absorption d’un composant n’est pas connu, il s’avère utile d’utiliser de multiples
longueurs d’ondes simultanément, voire même un détecteur à barrettes de diodes (DAD), qui
peut enregistrer l’intégralité du spectre UV. La technologie des barrettes de diodes permet de
confirmer la pureté et l’identité du composant en illustrant le spectre d’absorption de chaque pic,
éliminant ainsi la chromatographie sur couche fine nécessaire après le fractionnement. Ci-après
un exemple de l’analyse par barrettes de diodes de la caféine, de la vanilline et de la piperine.

Temps (min) Temps (min)

Figure 1: Chromatogramme typique avec un signal UV Figure 2: Représentation 3D des signaux UV (200-
moyen de 200-400 nm composants caféine, vanilline et 400nm) de caféine, vanilline et piperine montrant l’absorp-
piperine. tion maximale.

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 Scan at 6.95 min

Figure 3: Absorption détaillée du spectre UV de la courbe de vanilline

Avantages de la détection UV Limites de la détection UV

• Facile d’utilisation • Faible réponse si le composant ne

• Efficace possède pas un groupe chromophore
• Peu coûteux significatif
• Compatible avec des gradients solvants • Solvants limités par le seuil d’UV
• Non-destructif spécialement pour les UV à faible
• Relativement sensible (selon l’activité du longueur d’ondes
composant)
• Spécifique

Table 2: Avantages et limites de la détection UV

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Détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL)

Le mécanisme général du DEDL implique la mesure de la totalité de lumière diffusée par les
particules de solvant qui ont été séchées par un processus d’évaporation. Le processus se
compose de trois étapes : nébulisation, évaporation du solvant et détection (voir image ci-des-
sous). Pendant la nébulisation, un nébuliseur combine un flux de gaz d’air ou d’azote avec la
phase mobile de la colonne ou de la cartouche afin de produire un aérosol de microgouttelettes.
La prochaine étape consiste à introduire les gouttelettes dans un tube où la phase mobile
s’évapore et laisse derrière des particules du composant cible. Lors de la dernière étape, la
lumière traverse les particules séchées qui sortent du tube, et elle est diffusée à travers des
photons qui sont détectés par une photodiode.

Etape 1. Nebulisation Etape 2. Evaporation Phase Mobile Etape 3. Détection

Figure 4: Processus du DEDL

Le processus DEDL est décrit mathématiquement par des équations qui sont gouvernées par
la taille des particules. La zone de pointe (A) est directement liée à la quantité d’analyte dans la
colonne (m) :
A = amb

Ici m représente la masse du soluté, et a et b sont des constantes qui dépendent d’une variété
de facteurs tels que la taille de particules, la concentration et le type de substances cible, le
débit du gaz, le débit de la phase mobile et la température du tube.

Les détecteurs DEDL sont privilégiés pour la purification des composants sans groupe chromo-
phore. Cela concerne les carbohydrates, les lipides, les graisses et les polymères. La fonction
des détecteurs DEDL n’est pas perturbée par les variations de la phase mobile et du mouve-
ment du gradient. La sensibilité du DEDL n’est pas influencée par les propriétés chimiques et
physiques, elle est gouvernée uniquement par la quantité absolue du composant. Le DEDL est
un détecteur dépendant de la masse, ce qui signifie qu’un fort signal indique un grand volume
de composants en cours d’élution. Une technique semi-quantitative fournit des informations
précieuses concernant le ratio entre les composants de l’échantillon.

Le DEDL peut détecter presque tous les composants, à l’exception des analytes hautement vol-
atils, tels que l’éthanol dans le vin. Généralement, le composant d’intérêt doit être moins volatil
que la phase mobile. Tout modificateur dans la phase mobile doit être également volatil. Puisque
le détecteur DEDL est destructif, le volume d’échantillon transféré doit être minime. Plus le point
d’ébullition de la phase mobile est bas, plus il est aisé pour le solvant de s’évaporer. Les phases
mobiles avec des points d’ébullition élevés (ex : DMS, DMF, toluène ou eau), nécessitent une
évaporation à hautes températures, avec le risque de détruire la substance cible, ou la formation
de microgouttelettes, qui s’évaporent à la température ambiante.

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 Solvant Point ébullition °C

Diméthyle sulfoxide 189

N,N-Dimethylformamide 153

Toluéne 111

Eau 100

Propanol 97

Dipropyléther 90

Dichloroéthane 84

Acétonitrile 82

Cyclohéxane 81

Benzène 80

Ethyl acetate 77

Ethanol 78

Héxane 69

Tetrahydrofuran 66

Méthanol 64

Chloroforme 62

Acétone 56

Dichlorométhane 40

Table 3: Points débullition des solvants habituellement utilisés dans la chromatographie liquide flash et prep.

Avantages du DEDL Limites du DEDL

• Détecte tous les composants moins • Seulement les phases volatiles peuvent
volatils que la phase mobile être utilisées
• Sensibilité accrue • L’échantillon doit être moins volatil que
• Opération rapide la phase mobile
• Compatible avec le gradient – maintien • Le DEDL est une technique destructive
des niveaux stables pendant les
gradients

Table 4: Avantages et limites du DEDL

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Détecteur par spectrométrie de masse

La chromatographie liquide sépare les composants selon leur propriétés physico-chimiques,

alors que la spectrométrie de masse différencie les composants selon leur masse. Le spec-
tromètre de masse est un détecteur de chromatographie, qui permet l’identification des
molécules correspondant à chaque pic chromatographique, en se basant sur un spectre de
masse unique.
Les composants uniques d’un système de chromatographie liquide associé à un spectromètre
de masse sont illustrés ci-dessous :

Figure 5: Composants d’un système de chromatographie liquide avec spectromètre de masse

Le processus implique la transformation des analytes vers un état chargé ou ionisé. L’analyseur
de masse est un composant du spectromètre de masse qui sépare les masses ionisées en fonc-
tion de leur ration charge et masse. L’analyseur les envoie vers le détecteur qui les analyse et les
transforme en données numériques.

Avantages de la spectrométrie de masse Limites de la spectrométrie de masse

• Sensibilité accrue • Coût d’achat élevé

• Très sélective • Besoin de maintenance récurrent
• Fournit des informations structurelles

Table 5: Avantages et limites de la spectrométrie de masse

Détecteur par réfractométrie (RI)

L’indice de réfraction mesure les changements dans la réfraction de la lumière causée par la
phase mobile lorsqu’elle traverse une cellule de mesure. Le détecteur est non-sélectif et il en-
registre toutes les substances qui passent à travers la cellule. Les détecteurs réfractométriques
prennent des mesures selon le principe suivant :

= Différence entre les indices de réfraction

nG = Indice de réfraction de l’échantillon dissous dans le solvant
nL = Indice de réfraction du solvant pure
ni = Indice de réfraction de l’échantillon
c = Concentration de l’échantillon

Dès lors que l’indice de réfraction n’est pas spécifique, il est universellement applicable. Toute-
fois, ce type de détecteur n’est pas adapté à des applications avec une élution à gradient, car
l’éluant est toujours comparé avec le solvant pure, dans une cellule de référence. Le système est
ainsi sensible aux changements de composition de la phase mobile. De plus l’indicateur est très
sensible aux changements de température.

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 Avantages détection par RI Limites de la détection par RI

• Réponse universelle grâce au détecteur • Ne peut pas être utilisé avec des
• Plage dynamique accrue - ~4 ordres de gradients à solvants
grandeur • Faible sensibilité
• Facile d’utilisation • Très sensible à des variations de
température et de pression

Table 6: Avantages et limites de la détection par RI

Détecteur par fluorescence

Lorsque des composants avec des groupes fonctionnels spécifiques sont stimulés par une
bande passante plus courte, ils émettent une radiation plus forte ou une fluorescence. L’in-
tensité de la fluorescence est influencée à la fois par la stimulation et l’émission des longueurs
d’ondes, qui permet la détection sélective de certains composants. Approximativement 15% de
tous les composants possèdent une fluorescence naturelle. Certains d’entre eux contiennent
des composants aliphatiques et alicycliques avec des groups carbonyle et des composants
à double liaison. Les composants aromatiques avec des pi-électrons dégagent la plus forte
fluorescence. Les détecteurs par fluorescence offrent des niveaux de sensibilité parmi les plus
élevés. La sensibilité des détecteurs par fluorescence est de 10 à 1000 fois plus élevée com-
parée aux détecteurs UV.

Avantages de la détection par Limites de la détection par

fluorescence fluorescence

• Haute sensibilité • Linéarité limitée

• Haute sélectivité • Peu de composants naturellement
• Généralement, insensible aux flux et fluorescents
changements de température • Méthode de dérivation compliquée
• Utilisation compliquée – nécessite une
maîtrise des variables chimiques et
instrumentaux à la fois
• Certains produits chimiques, tels que
l’oxygène peuvent réduire la
fluorescence – besoin de dégazage

Table 7: Avantages et limites de la détection par fluorescence

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Combination de détecteurs UV et DEDL

En général, les utilisateurs en chromatographie préparative nécessitent des détecteurs univer-

sels, facile d’utilisation avec une haute sensibilité et une technologie non-destructive et sans au-
cune incidence sur la phase mobile. Cependant, aucun des détecteurs actuellement disponibles
ne remplissent pas tous les critères, comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

Compatible
Composants Facile
Détecteur Sensibilité avec le Destructive
détectés d’utilisation
gradient

UV Composants Dépendant Oui Non Oui

chromophores de l’activité du
composant

DEDL Composants Moyenne Oui Oui Oui

non volatiles

MS Composants Moyenne Oui Oui Non

ionisables

RI Universel Faible Non Non Oui

Fluorescence Composants Elevée Oui Non Non

fluorescents

Table 8: Résumé des méthodes de détection utilisées en chromatographie flash et prep

La détection par UV est la méthode utilisée par défaut en chromatographie préparative, car
il s’agit d’une technique bien établie, et de nombreuses molécules absorbent les rayons UV.
Cependant, pour certaines applications, la détection par UV seule peut ne pas donner les niveaux
de puretés satisfaisants. Spécialement, en synthèse, la détection des composants dans la mix-
ture de réaction est cruciale pour une séparation efficace, car des fois, l’utilisateur lui-même n’est
pas sûr si tous les composants sont sensibles aux UV. Par conséquent, un autre détecteur, de
préférence un DEDL, est associé afin de répondre aux exigences des chimistes. Les détecteurs
UV et DEDL sont faciles d’utilisation, compatibles avec le gradient et présentent des niveaux de
sensibilité corrects. Le DEDL est une technique destructive mais on peut y pallier en choisissant
un détecteur avec un échantillonnage de quelque microlitres. De plus, l’association de détec-
teurs UV et DEDL permet la détection de la quasi-totalité des composants : chromophores et
non-chromophores, ainsi que volatiles et non-volatiles (voir figures ci-dessous).

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 Solvant % DEDL UV1 UV2
DEDL (mV)

Temps (min)

CH3 O O
CH3
H3C H
CH3

O
H 3C H
OH OCH3
H
H

H3C O H2N HO

Cholesteryl acétate Méthyle Parabène 4- Acide Aminobenzoic

(non-chromophore) (chromophore) (chromophore)

Figure 6: Séparation de composants chromophores et non-chromophores dans une mixture

DEDL (mV)

Temps (min)

O O O

N N H O
HO
N HO
O N
OCH3 O

Cafféine (non-volatile) Vanilline (hautement volatile) Piperine (non-volatile)

Figure 7: Séparation de composants volatiles et non-volatiles dans une mixture

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Références

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dische Grundlagen der HPLC. Weinheim, Germany: VCH.

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https://pdfs.semanticscholar.org/86fe/6906062968f3e659798669428c1a119f063a.pdf

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