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Larvlationenchromatographie

La
rvlation en chromatographie
surcouchemince

Est elle un art?


Estelleunart?

Paul Klee
PaulKlee

tudiant pharmacognosie
tudiantpharmacognosie

UNIVERSITEFRANCOISRABELAIS
TOURS
JolleDorat*.MichellePinault**.
JacquesPothier
Jacques Pothier*
laboratoireNutrition,CroissanceetCancerde
l i I
lquipeInsermU921delafacultde
U921 d l f l d
mdecinedeTOURS
Laboratoiredepharmacognosie
AvenueMonge37200tours
A
M
37200 t

R l ti
Rvlation,Drivatization
D i ti ti
Laphasedelachromatographiecouchemince
malmatrise.
Evaluationqualitative
Rvlationparpulvrisation
R l ti
l i ti
Rvlationparimmersion
Rvlationbiologique
EvaluationsouslampeUVetvido
Evaluation sous lampe UV et vido

Les plaques sans rvlation


Lesplaquessansrvlation
llaplaquecontientunindicateurfluorescent
l
i
i di
fl
:on
soumetlaplaqueunrayonnementUVetles
composssontrvlssousformedetaches

t l
f
d t h
sombres.
lesUV(254nm) :enexposantlaplaqueune
sourcederadiationUV,certainscomposs
(systmesconjugusouaromatiques)
apparaissentsousformedetachesbrillantes.

L iode un grand classique


Liodeungrandclassique
liode :onplongelaplaquedansunbocal
y
p
contenantunfonddiodebroy.Lescomposs
apparaissentsousformedetachesbruntres.

Les piges de la rvlation


Lespigesdelarvlation
Mauvaisschageavantlarvlation
Mauvaischauffageaprsapplicationdu
Mauvais chauffage aprs application du
rvlateur

IMPORTANCEDUSECHAGE
PREALABLE
il dpend des composs isoler et des luants
sii lluant
ll
t estt acide
id ou basique
b i
il faut
f t un schage
h
pralable avec chauffage pour viter une raction
luant
l ant rvlateur
r late r

Exemples alcalodes de l opium


Exemplesalcalodesdelopium
Opium par AMD au Dragendorff
Laboratoire de pharmacognosie Tours

Dragendorff 1 sansschage,2 schage,3 schageplus


acideformique
opiumavecluantalcalin

Opiumiodoplatinate ractifpeuacidenondestructifdela
molcule

1mauvaisschage2bonschage

IMPORTANCE DU SECHAGE PREALABLE


IMPORTANCEDUSECHAGEPREALABLE
sionchromatographiedesproduitsvolatiles
commeleshuilesessentiellesviterbien
videmmentunschagetropchaud
Laisserparexemples
Laisser par exemple svaporer
vaporerllluant
luantdela
de la
plaquesouslahotteaspirante

Rvlation puis chauffage


Rvlationpuischauffage
La
Laplaquechauffante
plaque chauffante
estprfrableltuve
pour:
Unemeilleure
homognitdela
temprature.
temprature
Unemeilleursuivi
delarvlation.

A viter ( proscrire)
Aviter(proscrire)
Lechauffagecow
h ff
b
boy
boy

Le chauffage
L
h ff
bonne
b
maman

Pulvrisation
Imprgnationdelacoucheparpulvrisationdune
substanceractive.
Reproductibilitdifficiletrslieloprateur
puissancedepulvrisation
puissance de pulvrisation
distance
dure
d re
balayage,homognitdufonddeplaque

Pulvrisateurs

Rvlation par vaporisation


Rvlationparvaporisation
Lavaporisationdunractifsurlaplaquencessiteunminimum
d i
dquipement,maissurtoutdesprcautionspourseprotgeret
t
i
t td
ti
t
t
protgerlenvironnementdesvapeurstoxiques,etunemthode
bienmatrisepourlimiterlemanquedereproductibilitetlebruit
defond.

Schmadevaporisation

Rvlation par immersion


Rvlationparimmersion

Larvlationpar
immersion delaplaque
de la plaque
danslasolutionderactifs
estdeloinlameilleure
solution(nonpolluante,
reproductible,quantitative)
d tibl
tit ti )
maisattentionauxexcs
d chantillonsurlaplaque,
et aux rvlations
etauxrvlations
multiples.

Plaquedestrodes
rvlsauractif
phosphomolybdique

Chromatogrammestablissantunecomparaisonentre
pulvrisationettrempage

d H h D i t
daprsHahnDeinstrop

Mthodes de Drivation
MthodesdeDrivation

UV254et366nm
Pulvrisation
Trempage
Exposition aux vapeurs
Expositionauxvapeurs
Ractifsdanslesolvant
Ractifdansladsorbant

Ractifs non spcifiques


Ractifsnonspcifiques

Acidesulfuriquepluschauffage
Vanillinesulfuriquepluschauffage
Acidephosphomolybdiquepluschauffage
Anisaldhyde sulfurique plus chauffage
Anisaldhydesulfuriquepluschauffage
SeldeBleusolideB

Ractifs Gnraux des Alcalodes


RactifsGnrauxdesAlcalodes
Dragendorff
Actique(selonMunieretMacheboeuf)
Actique (selon Munier et Macheboeuf)
Chlorhydrique(basespuriques)
(C l ti d
(Colorationduorangeaurougesurfonddeplaque
f dd l
jaune)

Iodoplatinate depotassium
((Couleursallantduroseaubleuintenseen
passantparleviolet)

R tif d Ht id fl
RactifsdesHtrosidesflavoniques
i

Potassealcoolique
Ractif au chlorure ferrique
Ractifauchlorureferrique
Ractifautrichloruredaluminium
RactifdeNEU(NP/PEG)

Mcanismeractionnelavec
leRactifdeNEU

+
O - NH2
B

+
OH
OH

- OH
2

HO

CH2

CH2

O
B

ChromatogrammesdeGinkgobiloba
DaprsWagner

Ractifs les plus couramment utiliss


Ractifslespluscourammentutiliss
V
Vapeurs
Iode
Ammoniaque
Dragendorffactiqueouchlorhydrique(alcalodes)
Iodoplatinate (alcalodes)
Aniline(carbohydrates)
AcideDiphnylborique (Flavones)
AcidePhosphomolybdique
Acide Phosphomolybdique +chauffage(strodes,phnols)
+ chauffage (strodes phnols )
Acidesulfurique+chauffage(substancesorganiques)
Anisaldhyde sulfuriqueouactique
sulfurique ou actique +chauffage
chauffage
(sapognines,huilesessentielles)

Ractifs les plus couramment utiliss


Ractifslespluscourammentutiliss

Dichloroquinone4chlorimide(Phnols,indoles)
Di
hl
i
4 hl i id (Ph l i d l )
SeldeBleuSolideB(cannabinodes,phnols,tannins)
Rctif de Neu (NP/PEG) (Flavones)
RctifdeNeu(NP/PEG)
Vanillinesulfurique(Strodes,saponineshuilesessentielles)
TrichloruredAntimoine(terpnes,strodes,sapognines)
Acidetrichloractique+chloramineT(H.cardiotoniques)
Dinitrophnylhydrazine(Aldhydesetctones)
PDAB Para dimthylaminobenzaldhyde (Indoles)
PDAB=Paradimthylaminobenzaldhyde(Indoles)
Acidechlorhydrique acideactique

Des rvlateurs trs utiliss


Desrvlateurstrsutiliss
Anisaldhyde sulfurique1cannabis2 opium3
ginkgo4ginseng

acidephosphomolybdique
1cannabis2ginkgo3ginseng

Diffrencesentredeuxrvlationsla
vanilline chlorhydrique et sulfurique
vanillinechlorhydriqueetsulfurique
Huileessentielleextraitdecranberry

Choix de la plaque
Choixdelaplaque
Expriencercente
Nepaschangerdefournisseurdeplaque
Ne pas changer de fournisseur de plaque

Ne pas changer de fournisseur


Nepaschangerdefournisseur
Plaquemerck

Plaque x
Plaquex
Mmeluantmmervlation

glycolipides
Exempledemiseaupointdunemthodede
rvlation

Diffrentsrvlateursutilissettestssurdes
glycolipides.
glycolipides

Cesmanipulationsonttralisesdansle
laboratoireNutrition,CroissanceetCancerde
lquipeInsermU921delafacultde
mdecine de TOURS avec laide
mdecinedeTOURS,avecl
aidedel
de lquipe
quipede
de
MonsieurBernardSavarydulaboratoire
Camag et les conseils de Monsieur Jacques
CamagetlesconseilsdeMonsieurJacques
Pothier

DeuxmolculesAetB, drivsglycolipidiques
p
diffrentparunesubstitutionensn3.
(Ractifs :Primuline,Berbrinesulfatede
cuivre avecacideorthophosphorique,Acide
avec acide ortho phosphorique Acide
sulfuriquediffrentsdosages.

Acidesulfurique10%danslthanol :20mLdacidesulfuriqueavec180mL
dthanol.Lesplaquessontchauffes130Cpendant5min.
ImageavecplaquedriveenWRT

Ractifaveclesulfatedecuivre
R
tif
l
lf t d
i
:20gdesulfatedecuivredissousdans200mLde
20 d
lf t d
i
di
d
200 L d
mthanolauquelonajoute8mLdacidesulfuriqueet8mLdacideortho
phosphorique(85%).Lesplaquessontchauffes140Cpendant30min.

UV 366

Berbrine

Test la primuline surmolculec


Testlaprimuline
sur molcule c

Les ractifs retenus


Lesractifsretenus

Remerciements
Les tudiants en pharmacognosie
Lestudiantsenpharmacognosie
MichellePinault
Joelle Dorat
Paul Klee
PaulKlee
Nicolasdestael

Nicolas de Stal
NicolasdeStal

Nous vous
remercions pour
votre coute

Acidesulfurique10%danslthanol :20mLdacidesulfuriqueavec180mL
dthanol.Lesplaquessontchauffes130Cpendant5min.
ImageavecplaquedriveenWRT

Ractifaveclesulfatedecuivre
R
tif
l
lf t d
i
:20gdesulfatedecuivredissousdans200mLde
20 d
lf t d
i
di
d
200 L d
mthanolauquelonajoute8mLdacidesulfuriqueet8mLdacideortho
phosphorique(85%).Lesplaquessontchauffes140Cpendant30min.

.Les2ractifsensemblesontappropris.Les2molculesAetBsontsparesmaisilfaudrait

unemeilleureposition,ellesrestentbassessurlaplaque.
Lervlateurpeuttreutilis.

Test primuline surmolculec


Testprimuline
sur molcule c