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TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011
Licence Sciences, Technologies, Sant mention Biologie
UE 6.3 b : Bactriologie et Virologie Gnrales


MATERIEL : Travail en binme
- une blouse en coton Etuve : groupe du matin, tage du haut
- un feutre indlbile groupe de laprs midi, tage du bas
- un lastique cheveux Pipetage uniquement avec poires

1re semaine

PROGRAMME DU TP : LE COURS ET LES TD DOIVENT ETRE COMPRIS
Travail strile
Identification de 3 souches
Identification prsomptive de souches dun mlange

- Techniques de base :
- Travail strile
- Etat frais
- Coloration de Gram
- Ensemencement
- Isolement sur milieux gloss slectifs et non slectifs
- Identification bactrienne par ltude des caractres mtaboliques et antigniques

I - TRAVAIL STERILE (J1, J2)

1) J1
A partir dun bouillon Trypticase Soja (TS) de 10 mL (tube essai), transvaser strilement 2
mL dans 5 tubes hmolyse laide dune pipette Pasteur.
- 2 bouillons serviront au test de strilit : les incuber 24h 37C.
- les 3 autres bouillons serviront pour lidentification des 3 souches (voir II).

2) J2
Les 2 bouillons non ensemencs sont-ils limpides ? Conclusion.


II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES (J1, J2, J3)
Chaque binme reoit 3 souches isoles sur glose TS en vue dune identification.

1) J1

- Caractres morphologiques. Pour chacune des 3 souches, raliser sparment :
- Gram (objectif x 100 limmersion). Dessiner la forme exacte (allonge, ovale, ronde,
incurve, ). Prciser le groupement.
- Etude de la mobilit
- ensemencement dun milieu semi-solide mannitol-mobilit : piqre centrale avec 1 colonie.
- ensemencement dun bouillon TS de 2 mL avec 1 colonie.

- Risolement - Faire scher 3 gloses TS 30 min. ltuve.
- Isoler partir du bouillon TS ensemenc par 1 colonie chaque souche
sur une glose TS par la mthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant.

Semaine 1

2
2) J2
Etudier sur les 3 souches :

- Caractres morphologiques.
- tude de la mobilit :
- lecture du milieu mannitol-mobilit.
- tat frais entre lame et lamelle partir du bouillon TS (objectif x 40 sec).
- tude macroscopique des colonies

- Mtabolisme nergtique - TESTS REALISER SUR LA MEME LAME -
- catalase : Dposer 1 goutte de H
2
O
2
puis les colonies avec 1 pipette Pasteur.
- oxydase : Dposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Dposer les colonies avec
une pipette Pasteur la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si cest la colonie qui
vire qu rouge.


Etudier selon lidentification prsomptive de la famille ou du genre :

- Caractres mtaboliques
- pour bacilles Gram -
Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilit ensemenc en J1.
Ensemencement dune galerie didentification simplifie en tubes (voir fiches techniques) :
- milieu de Kligler-Hajna
- milieu de Clark et Lubs (pour raction de RM et VP)
- milieu ure-indole de Ferguson
- recherche de la nitrate rductase sur mannitol-mobilit.
Ensemencement dune galerie API 10E.

- pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +)
Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).
Recherche dune DNAse : ensemencer une glose lADN.
Recherche dune coagulase : agglutination de particules de latex sensibilises par du fibrinogne.

- pour streptocoques (coques Gram +, catalase -)
Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).
Etude des caractres antigniques ( faire ventuellement J3) :
Recherche du polyoside C parital : 1- extraction du polyoside C : mettre 20 colonies
en suspension dans 0.5 mL denzyme dextraction. Incuber 10 min. 37C au bain-marie
2- raction dagglutination de particules de latex
sensibilises par des anticorps spcifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D.

3) J3
- pour bacilles Gram -
Rvlation et lecture de la galerie didentification en tubes.
Test ONPG : uniquement si la bactrie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna).
Rvlation et lecture de la galerie API 10E.
Comparaison des rsultats obtenus par les 2 mthodes.

- pour les staphylocoques
Rvlation de la DNAse.
Semaine 1


3
III - ETUDE DUN MELANGE DE GERMES (J1, J2, J3)
Chaque binme reoit un bouillon TS renfermant un mlange de germes.

1) J1
- Etude morphologique
- Etat frais : mettre 1 anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer (cf. fiche
technique).
- Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame.

- prsomption : types de germes prsents (forme, groupement, mobilit, Gram)
- choix de milieux de culture slectifs ou non pour lisolement de ces bactries

- Isolement sur milieux solides :
Faire scher les gloses 30 min. ltuve avant lisolement
- sur milieu non slectif (glose TS) qui permettra la croissance de toutes les bactries
- sur milieu(x) slectif(s) si ncessaire pour inhiber certaines bactries :
- milieu de Chapman slectif pour staphylocoques et microcoques
- milieu de Drigalski slectif pour bacilles Gram - courants (entrobactries,
Pseudomonas, Vibrion).

2) J2
- Voir la qualit des isolements. Si besoin, risoler.
- Lecture des milieux Chapman et Drigalski.
- Comparaison des isolements entre eux. Aspect macroscopique des colonies.

- Identification prsomptive de chaque germe :
- Gram
- oxydase
- catalase
- type respiratoire : Lecture des gloses Viande Foie (VF). VOIR clichs fournis
Les gloses VF ont t ainsi prpares. Les VF sont pralablement rgnres 20 min. au bain-
marie bouillant et ramenes 55C. Elles sont ensemences avec une colonie sur toute la
hauteur du tube puis solidifies immdiatement en passant le tube sous leau froide. Les VF sont
incubes 24h 37C. Le bouchon est lgrement dviss pour laisser lair pntrer.
AUCUN AUTRE TEST faire

3) J3 Finir les lectures des tests.

COMPTE RENDU par binme : rendre imprativement en J3 la fin de la sance :

- Travail strile.
- Identification des souches : classer les rsultats par souche ; regrouper les tests pour
dgager la logique de la dmarche dune identification.
- Identification prsomptive des germes du mlange.
- Inclure une note sur : - principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et
Drigalski. - principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark et
Lubs, ure-indole et du test de la recherche de la nitrate rductase.
- dfinition des entrobactries.
NB : - Ne pas oublier le n des 3 souches tudies et la lettre du mlange.
- Les comptes-rendus ne doivent pas dcrire les techniques utilises mais doivent
comporter les rsultats et la dmarche suivie si possible sous forme de tableau.
Semaine 1

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TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011

Licence Sciences, Technologies, Sant mention Biologie
UE 6.3 b : Bactriologie et Virologie Gnrales

2me semaine
PROGRAMME DU TP :
I - CMI et CMB vis vis de la streptomycine - Dnombrements bactriens
II - Mutation - Antibiogrammes par diffusion en glose
III - Conjugaison - Antibiogrammes par diffusion en glose
IV - Examen individuel

I - CMI et CMB VIS A VIS DE LA STREPTOMYCINE (J1, J2, J3)
CMI : plus faible concentration dantibiotique inhibant toute croissance visible
CMB : plus faible concentration dantibiotique ne laissant subsister que 0.01% de
linoculum initial
Une solution mre dantibiotique 10 g/L est distribue. Calculer le volume de solution mre
dantibiotique ajouter pour avoir 2 mL de milieu 1024 mg/L.
1) J1 : Prparation commune aux CMI et CMB :
- Inoculer un bouillon TS avec 1 colonie de la souche donne sur glose TS et incuber ce
bouillon 1 2h 37C en bain-marie agit.
- Prparer pendant ce temps la gamme de dilution de lantibiotique (solution mre 10 g/L):
Prparer dans des tubes hmolyse bouchs coton des dilutions gomtriques de raison 2
de lantibiotique dans du bouillon MH strile sous un volume final de 1 mL de faon obtenir
une gamme allant de 1024 8 mg/L et 1 tube tmoin sans antibiotique soit 9 tubes.
- Prparer une dilution du bouillon de culture au moins au 1/10 en bouillon MH (cette dilution
doit tre parfaitement limpide).
Rpartir 1 mL de cette dilution dans chaque tube de la gamme dantibiotique (la
concentration finale en antibiotique va de 512 4 mg/L). Commencer par le tube tmoin.
- Numration de linoculum initial. - Faire scher 30 min. 1 glose TS avant utilisation -
Le tube tmoin sans antibiotique (1 mL de bouillon MH + 1 mL de suspension
bactrienne dilue au 1/10 en bouillon MH) est utilis pour valuer linoculum initial (il devrait
renfermer 10
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bactries viables/mL) : Faire 4 dilutions de raison 10 en eau distille strile (50
L dans 450 L) : 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
qui serviront pour linterprtation des CMB car elles
correspondent respectivement 10%, 1% 0.1% et 0.01% de survivants. Ensemencer 50 L des
diffrentes dilutions et de lchantillon non dilu (100% de survivants) sur la glose TS.
- Incuber les tubes et les botes 18 24h 37C.

2) J2
- Lecture de la CMI
Dterminer la CMI
Prcisez la catgorie S, R ou I de la souche
Dnombrer les colonies bactriennes de linoculum. Calculer le nombre de bactries par mL de
bouillon (chaque bactrie a donn naissance une colonie) en tenant compte des dilutions.
- Dtermination de la CMB
Dnombrer les survivants sur milieu glos pour tous les tubes limpides (sans pratiquer de
dilution) : Scher 30 min. 1 glose TS - Ensemencer 50 L de chaque tube limpide sur cette
glose TS - Incuber les gloses 37C.

3) J3 - Lecture de la CMB - Dterminer la CMB en comparant le nombre de survivants
dnombrs dans chaque tube limpide la gamme talon de linoculum initial.
Semaine 2

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II - MUTATION (J1, J2, J3)
- Principe. Slection de mutants spontans rsistants lacide nalidixique par la
technique du gradient de Szybalski.

1) J1
- Prparation du milieu de culture :
On dispose de solutions mres dantibiotiques 10 g/L. La concentration finale en acide
nalidixique dans la glose Mueller Hinton (MH) doit tre de 40 g/mL.

- Calculer le volume de solution mre dantibiotique ajouter 20 mL de glose.
- Ajouter lantibiotique 20 mL de glose de MH fondue et refroidie 50C.
- Couler dans une bote de Petri. Laisser solidifier en position incline.
- Lorsque la glose est solidifie, reprer laxe et le noter sur le fond de la bote.
- Mettre la bote plat et rtablir le niveau avec 20 mL de glose MH sans antibiotique
fondue et refroidie 50C.
- Laisser solidifier. Lantibiotique va diffuser et il stablit un gradient de concentration
allant de 0 40 g/mL.
- Mettre scher au moins 30 min. ltuve avant utilisation de la glose.

- Prparation de la souche bactrienne
La souche Escherichia coli 2 est distribue sur glose Trypticase Soja (TS).
Prparer une suspension trs dense (comme du lait concentr) dans 1 mL deau distille
strile ( 10
10
bactries/mL).
Ensemencer le milieu de culture par talement au rteau de 0.2 mL de suspension bactrienne.
Incuber 24h 37C.

- Sensibilit aux antibiotiques ( voir fiche technique) :
Pratiquer un antibiogramme par la mthode des disques pour vrifier la sensibilit de la souche.
Faire scher 10 min. 2 gloses de Mueller-Hinton.
Ensemencer ces 2 gloses MH avec la mme suspension bactrienne. Tester :
Bote 1 : sulfamides, trimthoprime, acide nalidixique, streptomycine, kanamycine, gentamicine.
Placer un disque de rifampicine au centre.
Bote 2 : amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique, cfalotine, cfotaxime, ticarcilline,
pfloxacine.

2) J2
- Lire lantibiogramme (voir fiche technique).
- Reprer et compter les colonies de mutants rsistants qui ont pouss dans la partie de la bote
o lantibiotique est le plus concentr.
- Pratiquer un antibiogramme par la mthode des disques sur une colonie pour vrifier
lapparition de la rsistance. Utiliser une suspension bactrienne moins dilue pour ensemencer 1
glose MH prsche 10 min. : 1 colonie dans 10 mL deau distille.
Dposer les antibiotiques de la bote 1 et rajouter la pfloxacine au centre.

3) J3
Lecture de lantibiogramme.
Semaine 2

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III - CONJUGAISON (J1, J2, J3)
- Principe. Mise en contact directe de deux bactries et transfert dune information gntique
dune bactrie donneuse possdant les gnes tra+ vers une bactrie receveuse (J. LEDERBERG
et E. TATUM, 1946). Dans le TP, la slection du transconjugant (recombinant stable) se fait sur
un milieu de slection contenant deux antibiotiques ; un correspond au marqueur de rsistance
chromosomique de la rceptrice et lautre un marqueur de rsistance port par des plasmides
conjugatifs hbergs par la donatrice. La frquence de transfert est estime par le rapport entre le
nombre de transconjugants et le nombre de bactries donatrices.

1) J1
- Prparation du mlange Donatrice-Rceptrice :
Les bactries donatrice et rceptrice sont distribues en bouillon Trypticase Soja (TS).
Mlanger 1 ml de donatrice et 4 ml de rceptrice dans un tube strile.
Agiter doucement le tube pour homogniser le mlange.
Incuber 24h 37C dans le bain-marie sans agitation.

- Prparation du milieu de slection :
On dispose de solutions mres dantibiotiques 10 g/L. La concentration finale en acide
nalidixique et en kanamycine dans la glose Mueller Hinton (MH) doivent tre de 50 g/mL.
- Calculer le volume de solution mre dantibiotique ajouter 20 mL de glose.
- Ajouter les antibiotiques 20 mL de glose de MH fondue et refroidie 50C.
- Couler dans une bote de Petri.
- Laisser solidifier sans incliner.





2) J2
- Slection des transconjugants sur le milieu de slection sch :
- Isoler sur de bote le mlange Donatrice/Rceptrice. Etaler le contenu de 2 anses.
- Isoler sur de bote la Donatrice. Etaler le contenu de 1 anse.
- Isoler sur le de bote restant la Rceptrice. Etaler le contenu de 1 anse.
- Incuber la glose 24h 37C.

- Lecture des antibiogrammes de la Donatrice et de la Rceptrice.
Donatrice : La souche donatrice est la souche E. coli 2 utilise dans le paragraphe Mutation (J1).

Rceptrice : La souche rceptrice est une souche E. coli sensible toutes les molcules sauf
lacide nalidixique. La bactrie pousse au contact du disque dacide nalidixique.
- Relever son antibiogramme parmi les clichs fournis.

- Dnombrement de la Donatrice sur glose TS. Voir le clich numration donatrice :

En J1, 50 L des dilutions 10
-5
, 10
-6
et 10
-7
du bouillon de la donatrice ont t ensemencs sur
une mme glose. La glose a t incube 24h 37C.
- Calculer le nombre de donatrice par mL.
- Evaluer la concordance et la puret.
- Exploiter ce dnombrement en J3.

Semaine 2

NB. Donner aux enseignants
- Les bouillons de la Donatrice et de la Rceptrice. Ils seront stocks 4C (voir J2).
- Le milieu slecteur. Il sera mis scher ltuve puis stock 4C (voir J2).

7
3) J3
- Milieu de slection :
- Vrifier la slectivit du milieu.
- Reprer les colonies des transconjugants.
- Calculer le nombre de transconjugants par mL (volume 1 anse = 5 l).

- Estimer la frquence de transfert pour 24 h de croisement.
La frquence est le rapport entre nombre de transconjugants/ml et nombre de donatrices/ml.

- Lecture et interprtation de lantibiogramme du transconjugant :
- Utiliser lantibiogramme et/ou les clichs mis votre disposition dans la salle de TP.






COMPTE RENDU par binme : rendre imprativement en J3 la fin de la sance :

- CMI, CMB, rapport CMB/CMI, dnombrement du tmoin.
- MUTATION et INTERPRETATION des ANTIBIOGRAMMES de la souche E. coli 2
avant et aprs mutation.
- CONJUGAISON de la souche E. coli 2 et INTERPRETATION.
Ne pas oublier les n et nom des souches.

Utiliser le fichier compte-rendu L3 UE 6.3 b : Bactriologie et Virologie Gnrales disponible
sur le site web http://microbiologie.univ-tours.fr
























Semaine 2

8
III - EXAMEN PRATIQUE INDIVIDUEL (J2 et J3)

Documents autoriss :
Un mlange de germes en bouillon TS est distribu chaque tudiant pour
- isolement des diffrentes bactries sur milieux slectifs ou non
- Gram et Etat Frais (EF)
- identification au moins partielle (famille, genre ou espce) des bactries


Chaque tudiant est not sur :
- la qualit des isolements
- les colorations de Gram et tats frais
- sa dmarche
- son compte rendu

Les tudiants pourront utiliser les ractifs pour les tests oxydase et catalase.
Les tudiants devront indiquer lorientation de lidentification.
Les tudiants devront lister les milieux et ractifs quils utiliseraient pour aboutir
lidentification des germes.

AUCUNE AIDE NE SERA APPORTE POUR REGLAGE ET LECTURE GRAM et EF


COMPTE RENDU INDIVIDUEL A RENDRE A LA FIN DE LA SEANCE EN J3

Ne pas oublier le n du mlange.
Les comptes-rendus ne doivent pas dcrire les techniques utilises mais
doivent comporter les rsultats et la dmarche suivie si possible sous forme de tableau.

REMARQUE
Un examen thorique de Travaux Pratiques aura lieu pendant les sessions de juin et de
septembre sous la forme dun contrle crit de 30 minutes sans documents.


NOTATION DES TP
Compte rendu semaine 1 : sur 20
Compte rendu semaine 2 : sur 20 - une note moyenne sur 20
Examen pratique de TP : sur 20

Examen thorique de TP : - une note sur 20

Note finale sur 40 points, puis remise au coefficient de TP de lUE.

Semaine 2
Notation au cours de lexamen