Cours et TD microbiologie générale L2 Science Alimentaire

Dr BENADA Mhamed

TD N 05
Méthode d’identification des bactéries :
Apres isolement et purification des bactéries, l’identification s’effectue par une observation et
caractérisation biochimique et aussi caractérisation moléculaire.
1. Observation :
Ici on trouve 2 types d’observation qui sont :
1.1. Observation à l’état frais : s’effectue entre lame et lamelle a faible grossissement qui sont ×10
et ×40 et qui permettre de voir la présence ou absence des bactéries ainsi sa mobilité.
1.2. Observation après coloration : avant d’effectué les différents types de coloration on doit tout
d’abord préparer un frottis bactérien
 Préparation du frottis bactérien : mettre une goutte d’eau distiller sur une lame et prendre
une colonie bactérienne bien isoler et faire mélange, ensuite étaler sur toute la lame, sécher
et fixer.
 Coloration : ici on trouve diffèrent type de coloration qui sont : coloration de Gram, fushine
ziehl nielsen, ancre d chine …
On note que l’observation s’effectue à grossissement ×40
 Coloration de Gram :

2. Caractérisation biochimique : s’effectue par différents tests biochimique en utilisant galerie

classique ou à l’aide d’API.
Cours et TD microbiologie générale L2 Science Alimentaire
Dr BENADA Mhamed

On trouve différents types d’API et cela selon groupe de bactérie à rechercher et pour cela il faut tout
d’abord faire des tests primaires qui nous permettre de savoir le groupe bactrien avant les utiliser, parmi
ces tests on trouve Gram, Oxydase, Catalase.
3. Caractérisation immunologique : le principe de cette technique c’est d’utiliser un système
antigènes-anticorps, qui est spécifique.
On trouve différentes techniques et qui sont :
Immunofluorescence appeler aussi immunocytochimiques : permettent de localiser dans la
cellule des molécules bactériennes. On utilise des anticorps marqués par la peroxydase, la biotine
ou des molécules fluorescentes comme la fluorescéine. La formation d’un complexe stable antigène-
anticorps permet de repérer la présence d’une molécule dans la cellule.

Figure : immunofluorescence directe et indirecte

Teste de ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) : dans cette technique on utilise 2 types
d’anticorps qui sont monoclonal et polyclonal.
On met sur le support anticorps polyclonal qui va permettre de capter tous types de bactéries ensuite on
ajoute notre antigène et après on met anticorps monoclonal qui est spécifique pour antigène de la bactérie
à rechercher, par la suite on ajoute substrat qui est dégrader par des enzymes qui se trouve dans anticorps
spécifique, ensuite la lecture s’effectue par la lecture de la densité optique.
Cours et TD microbiologie générale L2 Science Alimentaire
Dr BENADA Mhamed

4- caractérisation génétique :
Se fait par la technique de PCR (polymérase chaine réaction), en premier lieux on doit faire une
extraction d’ADN, ensuite on fait identification en utilisant des amorces qui sont spécifique pour la
bactérie rechercher et la révélation s’effectue sur gel Agarose.
Il y a aussi RTPCR (real time PCR) qui s’effectue de manière directe, et la détection s’effectue par une
représentation graphique.

Figure : révélation sur gel d’agarose