TD2 MBIO0301 : Exercices sur l’identification et Exercices sur l’étude de géloses

Aidez-vous du fichier intitulé « document TP et TD MBIO0301 23-24 » déposé sur moodle au cours
intitulé « TD MBIO0301 identification bactéries »

Exercice 1 :

Après ensemencement d’un milieu riche à partir d’un échantillon bactérien provenant d’urines,
j’obtiens en un nombre assez important des colonies présentant des caractéristiques communes.

1) Quels sont les premiers tests à réaliser pour l’identification ?

Les tests suivants ont révélé :

Une absence de croissance sur milieu Chapman mais pas sur bouillon hypertonique (6,5% NaCl).
Une présence sur gélose esculine additionné de bile + azide de Na (Milieu BEA) avec formation d’un
précipité/halo noir autour de la bactérie.

2) Vers quelle genre puis-je m’orienter?

3) Quels doivent être les résultats des premiers tests réalisés ?

Exercice 2 :

Pour identifier un microorganisme, le manipulateur après avoir réalisé un isolement de la souche sur
gélose nutritive, procède aux examens suivants :

a- Après la réalisation d’une coloration de Gram, il fait l’observation suivante

au microscope optique à l’objectif 100 : N.B : la coloration est rose
Quelle information lui donne ce résultat ?

b- Il réalise un test d’orientation. Le résultat est négatif.

Quel est le test d’orientation qu’il a effectué ?
Vers quelle famille de microorganisme, ce résultat l’oriente-il ?

c- Il ensemence une gélose Viande-Foie, le milieu est trouble sur toute la hauteur après 24H de
culture.
Que peut conclure l’expérimentateur d’après ce résultat ?

d- Il décide de réaliser des tests biochimiques en galerie API 10S afin de continuer son
identification.

ONPG GLU ARA LDC ODC CIT│ H2S URE TDA IND OX
NO2

Résultats obtenu après incubation de la galerie API 24h à 37°C- fiche à remplir

A l’aide du tableau en ANNEXE donner les différentes caractéristiques biochimiques de la bactérie en

remplissant la galerie ci-dessus et déterminer la clé d’identification (cf CM2) :

D’après la clé d’identification obtenue quelle est la bactérie isolée sur GN – Aidez- vous de l’ANNEXE 2 ?
Exercice 3 : Gélose au sang : N.B : Aidez-vous du fichier pages 4-5, 18 et page 22

Composition de la gélose Columbia par litre d’eau distillée :

- Polypeptone ...................................................................................17,0 g
- Peptone pancréatique de coeur .......................................................3,0 g
- Extrait autolytique de levure.............................................................3,0 g
- Amidon de maïs ...............................................................................1,0 g
- Chlorure de sodium..........................................................................5,0 g
- Agar agar bactériologique ..............................................................13,5 g Résultat obtenu après croissance de
bactéries sur la gélose au sang (couleur
Après autoclavage et refroidissement : rouge avant ensemencement)

Addition de 5 ou 10 % de sang de mouton stérile. Le milieu convient à la culture de streptocoques,

pneumocoques, staphylocoques, Listeria, Erysipelothrix (bacille gram +).
Possibilité d’ajouter de la colistine ainsi que de l’acide nalidixique à 15 mg = ANC (Acide Naxlidixique Colimycine).

Discuter de la composition de cette gélose :

1) Qu’est-ce que la gélose Columbia ? Pourquoi contient-elle plusieurs peptones ?
2) Que permet l’apport de ce sang de mouton défibriné à la gélose columbia ?
3) A quoi conduit l’ajout possible d’ANC dans la gélose au sang ?

Exercice 4 : Gélose Hugh Leifson : N.B : Aidez-vous du fichier page 15-16 et page 21

De l'étude du métabolisme énergétique il découle qu’un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou
par voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus.
La dégradation d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du milieu :
- lors des respirations le glucide est oxydé en CO 2, par le dioxygène (ou un autre oxydant minéral);
- Lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu qu'ils acidifient
sensiblement.

Quantités pour 1l d’eau distillée : N.B : Le milieu se présente en tube est à un pH de 7,2
- Peptone pancréatique de caséine 2g
- extrait de levure 1g
- chlorure de sodium 5g
- phosphate monopotassique 0,3g
- Sucre (en général glucose) 10g
- Bleu de bromothymol 0,03g
- agar 3g

1) Discuter de la composition de cette gélose :

A quoi servent les différents composés ? Pourquoi l’agar est à cette concentration ?
N.B : Aidez-vous des documents annexes
2) Annoter le schéma suivant indiquant le protocole d’ensemencement de cette gélose
3) Interpréter les résultats de la figure 1 obtenus après incubation 24h à 37°C, sachant que
l’utilisation de peptones par la bactérie conduit à une alcalinisation du milieu.
 Niveau d’huile de paraffine

Fig 1 : résultat de l’ensemencement de 1 : Alcaligenes

faecalis ; 2 : Pseudomonas putida, 3 : Salmonella enterica

ANNEXES :
ANNEXE1 : Tableau de lecture des résultats de la Galerie API 10S
ANNEXE2 : Clés d’identification associées aux genres bactériens