Support des Travaux Pratiques

BIOCHIMIE STRUCTURALE
GBI S2

Dr. GHITA AIT BADDI

Dr. Btissam Mouria
I. Recommandations générales

1. les étudiants travaillent par binôme ;

2. le port de la blouse pendant toute la séance de TP est obligatoire ;
3. Il est indispensable de préparer la séance de TP : lire attentivement le texte du fascicule
correspondant à la manipulation du jour ;
4. Chaque binôme est tenu de nettoyer sa paillasse à la fin de chaque séance.

II. Précautions à prendre

1. Ne pas souffler les réactifs en introduisant dans les flacons des pipettes sales ;
2. Reboucher les flacons immédiatement après usage et les remettre à leur place ;
3. Ne jamais pipeter les réactifs toxiques ou corrosifs (acides et bases forts et solvants
organiques) directement avec la bouche. Utiliser pour cela une propipette ;
4. Vous allez manipuler des produits chimiques et biologiques, il est donc nécessaire de vous
laver les mains à la fin de la séance de TP ;
5. Ne pas remplir les burettes directement avec les grands flacons de réactifs. Utiliser un petit
becher ;
6. Ne pas fermer l’orifice de la pipette avec la pouce mais avec l’index ;
7. Réserver, à la fin de la séance, 10 minutes pour le rangement et le nettoyage de la
paillasse ;
8. Rincer les pipettes à l’eau distillée et les poser inclinées sur le bord du plateau ;
9. Vider la burette et la remplir d’eau distillée ;
10. Laver la verrerie avec de l’eau savonneuse (béchers, erlens, tubes à essai…) et la rincer à
l’eau distillée ;
11. Essuyer la paillasse avec une éponge propre ;
12. Ne pas jeter de papiers ni de réactifs dans les éviers ;

III. Recommandation pour la rédaction de votre compte-rendu

Le compte-rendu que vous devez obligatoirement remettre à l’enseignant à la fin de chaque

séance constitue l’essentiel de ce sur quoi vous serez noté.
Il devra comporter en haut et à gauche de la première page les noms et prénoms, l’année
d’étude, ainsi que la date et le titre de la séance.
Vous devrez également apporter un grand soin à la rédaction de votre compte rendu, dont le
plan est prédéfini par les questions que vous trouverez à la fin de chaque manipulation
proposée.
L’évaluation du compte-rendu –matérialisée par la note/20- obéira aux critères suivants :
1. Répondre aux questions posées dans l’ordre proposé
2. apporter des réponses précises, claires et concises (Ex. si on vous demande d’écrire le but et
le principe d’une manipulation, vous rechercherez dans l’introduction ce qui répond
exactement à cette question- tout autre détails superflus sera sanctionné !-
3. Il sera tenu compte dans la note du soin que prendra l’étudiant pour manipuler et ranger sa
paillasse ainsi que pour la présentation de son compte rendu.
4. Dans le compte-rendu, Cinq, voire six, mots clés résumant les molécules, macromolécules,
cellules… étudiés et techniques utilisées ;
5. Une partie « résumé » de 3 à 4 lignes où sera exposée très brièvement le but du TP, la où
les techniques principales utilisés et les résultats ;
6. Une partie « Introduction » correspondant à une présentation générale des molécules,
macromolécules, etc… étudiés en TP (ou de techniques dans le cas de compte rendu de TP
très simple). Vous rechercherez des informations, afin de présenter ces macromolécules (ou
les techniques) en élargissant par rapport à ce que vous avez vu en TP. Cependant cette
introduction doit toujours être en rapport avec les molécules ou les techniques que vous avez
étudiées en TP. Attention au copié collé sans queue ni tête, ou trop long, à partir du Web ;
7. Une partie « Matériel et méthodes » Matériels : les solutions utilisées, leurs concentrations,
les volumes, le matériel… Méthodes : les techniques utilisées et le principe de ces
techniques ;
8. Une partie « Résultats », dans laquelle vous présenterez les résultats sous forme de
tableaux, diagrammes, figures. Chaque figure, diagramme ou tableau devra être numérotés,
avoir un titre et être légendés. Si nécessaire les résultats seront regroupés en chapitre avec un
titre de chapitre ;
8. Une partie « Conclusion », dans laquelle vous conclurez sur la base des résultats obtenus,
avec le cas échéant une analyse critique des résultats (ne pas se désespérer dans le cas de
manipulations qui n’ont pas marché cela permet de faire une analyse critique) ;

Attention la présentation est forcément différente de celle du polycopié car le propos n’est
pas le même, donc il ne s’agit pas de faire un copié collé du polycopié !!!
Sur chaque page devra apparaître un en-tête reprenant le titre du TP, ainsi qu'un pied de
page contenant la numérotation des pages.
 TP N°1 : CARACTERISATION CHIMIQUE DES GLUCIDES

I. Réactions furfuraliques
1. Principe :
En milieu fortement acide et à chaud, les oses ayant au moins 5 atomes de carbones subissent
une déshydratation et se transforment en furfural (si l’ose est un pentose) ou en un dérivé du
furfural (si l’ose est un hexose).

Le furfural et ses dérivés peuvent se condenser avec des substances telles que les phénols, les
amines aromatiques pour former des produits colorés caractéristiques.
2. Matériel
- tubes à essais
- bain marie bouillant
- pipettes
- propiettes ou poires d’aspiration
3. Réactifs
- solutions de glucose, fructose, mannose, ribose, saccharose et lactose à 1% dans l’eau
distillée.
- HCl concentré
- HCl 1N
- H2SO4 concentré
- Lugol (mélanger 1g d’iode avec 2g d’Iodure de potassium dans 100 ml d’eau distillée).
- α-naphtol à 1%.
4. Modes opératoires :
4.1- Réaction au α-naphtol
Dans un tube à essai, introduire 0,5mL de solution inconnue, et ajouter 1 goutte d’une
solution d’α-naphtol à 1%. Mélanger le tout. Puis agiter, faire couler doucement 0,5mL
d’H2SO4, le long de la paroi du tube incliné. Le chauffage est inutile : L’élévation de
température résultant du mélange de l’acide et de l’eau de la solution de sucre suffit à
déclencher la réaction.
Résultat : Un anneau rouge-violacé se développe au niveau de la surface de séparation des
deux liquides, en même temps, qu’une coloration verte apparaît dans le liquide inférieur.

4.2 Réaction à l’iode :

Le lugol ou l’eau iodée (I3-) se fixe sur les chaînes polysaccharidiques pour donner des
complexes colorés. La réaction du lugol avec le glycogène donne une coloration brune alors
qu’on obtient une coloration bleue-noir avec l’amidon.
Mode opératoire.
1. Préparer 4 tubes à essai : mettez dans le premier tube 2 ml d’une solution inconnue A, dans
le deuxième tube 2 ml de solution de mannose, dans le troisième tubes 2 ml de solution
inconnue B et dans le quatrième 2 ml d’eau distillée.
2. Ajouter 1 ml d’HCl 1N à chaque tube
3. Ajouter 1 à 2 gouttes du lugol dilué
4. Observer et noter les colorations obtenues

II. Présence d’amidon dans les cellules

• Matériel privilégié :
Tout organe de réserve contenant de l'amidon (tubercule de pomme de terre)
• Protocole expérimental :
- Prélever une partie du végétal à étudier.
- Procéder à des coupes transversales très fines.
- Déposer ce matériel dans un verre de montre avec quelques gouttes d’eau iodée.
- Laisser 2 minutes.
- Monter entre lame et lamelle dans une goutte d’eau iodée.
- Observer au microscope optique, la coloration brune mettant en évidence la présence
d’amidon.
• Astuce:
En utilisant un matériel spécifique (feuilles d’Elodée, épiderme de poireau…), il est possible
de se dispenser des coupes fines.
• Remarque :
- Pour bien comprendre la signification du test à l’eau iodée, il est intéressant de faire en
parallèle un test (eau iodée + amidon et eau iodée+ eau distillée dans des tubes à essai)-->
notion de témoin.

• Résultats possibles :
III. Présence de l’amidon dans la pomme de terre

a. Test caractéristique de la présence d’amidon

Déposer une rondelle de pomme de terre dans une coupelle. Ajouter quelques gouttes d’une
solution de diiode (lugol)
- Schématiser l’expérience et noter les observations.

TP2. DETERMINATION DU pHi DE LA GLYCINE

I. DETERMINATION DU pHi DE LA GLYCINE
Les acides aminés en solution sont toujours sous formes chargés. Cette charge dépend du pH,
de la force ionique et des constantes de dissociation de leurs fonctions.
En milieu acide ces composés amphotères gagnent des protons. La fonction a-CCOH qui a la
constante de dissociation la plus forte donc le pK le plus bas, va s’ioniser la première.
L’AA portera à la fois la charge positive et négative. Au moment où les charges + et –
s’équilibrent, le pH du milieu correspond au point isoélectrique (pHi).
En milieu basique, l’AA perd un proton et sera chargé négativement.
1- Cas d’un acide aminé neutre : ex. la glycine (Gly)

On défini par pH isoélectrique, pHi, le pH pour lequel la charge nette de la molécule est nulle
c'est-à-dire le pH auquel va prévaloir la forme ion dipolaire ou zwitterion A±. On calcule ce
pH à partir des constantes de dissociation ka et kb des fonctions ionisables. D’où :

1. But:
Détermination des pk et du pHi de l’acide aminé, glycine ou glycocolle (Gly)
2. Principe :
Il s’agit de suivre l’évolution du pH sur un volume déterminé d’une solution d’AA de pH
égale à 2, en fonction de la quantité de NaOH ajoutée.
3. Matériel et réactif :
- pH mètre
- Agitateur, barreau aimanté
- Burette
- Béchers
- Solution NaOH 0,2N
- Solution de glycine 20mM (0,02M)
- Solution d’HCL 2N
4. Mode opératoire :
* Attention : Les électrodes sont très fragiles et coûteuses
• Prière : - de ne pas laisser le barreau aimanté les heurter pendant l’agitation
- de ne pas les laisser à sec
- de bien les rincer avant et après la titration avec de l’eau distillée
- Mesurer 50 ml de la solution d’AA à l’aide d’une éprouvette
- Verser la solution d’AA dans un bêcher de 100 ml
- Après étalonnage du pH mètre, rincer l’électrode du pH mètre à l’eau distillée, et la placer
dans le bêcher contenant la solution d’AA
- Mesurer le pH de départ de la solution et le ramener à pH 2 avec quelques gouttes d’HCl 2N
- Mettre dans la burette la solution de NaOH 0,2N
- Titrer la solution d’acide aminé en ajoutant la solution de soude par additions successives de
0,5 ml tout en agitant.
- Pour chaque volume de soude ajouté, noter ce volume et noter la valeur du pH
correspondante et ce jusqu’à pH 10,5.
5. Exploitation des résultats
- qu’appelle-t-on le pH isoélectrique de l’acide aminé en solution ?
- tracer la courbe de titration pH = f (VNaOH)
- déterminer à partir de cette courbe les différentes valeurs de pK et le pHi de cet acide aminé.
 TP3. DOSAGE COLORIMETRIQUE DES PROTEINES

Principe d'une gamme étalon et d'une droite étalon

On utilise trois types de solution :

1. une solution de la protéine dont on veut déterminer la concentration.

2. une solution de concentration connue d'une protéine considérée comme une référence ou
un standard par rapport à la protéine dont on veut déterminer la concentration. Cette
protéine de référence peut être la même protéine que celle que l'on veut doser.

3. une solution de réactif qui développe une coloration en réagissant avec des acides aminés
spécifiques de ces protéines.

La solution de concentration connue permet de constituer une gamme étalon : série de tubes
qui contiennent un volume identique mais des quantités croissantes et connues de la
protéine de référence.
En parallèle, une série de tubes, contenant différents volumes de prise d'essai de la protéine
dont on veut déterminer la concentration (l'échantillon à doser), est préparée. La solution de
réactif est ajoutée au même moment dans tous les tubes afin que la coloration se développe
dans les mêmes conditions pour la gamme étalon et l'échantillon à doser. L'absorbance de
tous les tubes est ensuite mesurée. Les valeurs obtenues à partir des tubes de la gamme
étalon permettent de tracer une droite étalon : absorbance = f (quantité). Cette
proportionnalité permet de déterminer la quantité de protéine contenue dans un volume de
prise d'essai de l'échantillon à doser. On en déduit alors la concentration de la protéine à
doser.

 Principe

DOSAGE DE L’ALBUMINE D’ŒUF PAR LA METHODE DE BIURET

REACTIF ET MATERIEL DE LABORATOIRE
SOLUTION D’ALBUMINE A 10 g / L : 250 ML
Séparer les blancs des jaunes de 5 gros œufs ( la masse d’un blanc d’œuf étant environ de 20
grammes par œuf )
Peser 19.37g de blanc d’œuf (utiliser pour cela une pipette compte goutte en plastique pour le
prélèvement), transférer dans une fiole de 250 ml, ajuster avec de l’eau physiologique Q.S.P
250 ml.
SOLUTION D’ALBUMINE A DOSER A 50 g / L
Peser 96.88 g de blanc d’œuf (utiliser pour cela une pipette plastique), transférer dans une
fiole de 250 ml, ajuster avec de l’eau physiologique Q.S.P 250 ml.

REACTIF DE GORNALL
1.5g de sulfate de cuivre hydraté à 5 H2O
6g de tartrate double de sodium et potassium
30g d’hydroxyde de sodium
1g de iodure de potassium
Eau Q.S.P 1 litre

EAU PHYSIOLOGIQUE
Solution de chlorure de sodium à 9g par litre
SPECTROPHOTOMETRE
GANTS
TUBES A ESSAIS
FIOLE JAUGEE POUR DILUTION DU SERUM A DOSER

RESULTATS

TUBE N° 0 1 2 3 4 5 ESSAI 1 ESSAI 2

dilution au dilution au
1/10 de la 1/5de la
solution à solution à
doser doser
ETALON A 10g/ L 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1 1
(ml)
EAU 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0
PHYSIOLOGIQUE
(ml)
REACTIF DE 4 4 4 4 4 4 4 4
GORNALL (ml)
ALBUMINE / TUBE 0 2 4 6 8 10
(mg)
ATTENTE A 30 30 mn 30 mn 30 mn 30 mn 30mn 30 mn 30 mn
L’OBSCURITE DANS mn
LE NOIR
ABSORBANCE 0 0.086 0.173 0.261 0.351 0.435 0.207 0.421
Lecture à 540 nm

N.B : Dans le blanc d’œuf il y a :

12.9% de protéine, 85% d’eau, 1% de sels minéraux, 0.3% de lipides, 0.8% de glucides.

L’essai peut être fait directement avec 1 ml de blanc d’œuf ( puis ajout de 4 ml de Gornall et
attendre 30mn à l’obscurité).

Comparaison de la méthode de Biuret à d’autres méthodes :

 Méthode Bradford Biuret Lowry
Lowry et al. (1951)
Bradford, M. (1976) Anal. Gornall et al. (1949) J.
Référence J. Biol. Chem. 193,
Biochem. 72, 248 - 256 Biol. Chem. 177, 751
251
Le biuret et le
Le bleu de Coomassie réactif de Folin-
(s'adsorbe sur le verre des Le biuret (NH2-CO- Ciocalteu
Réactif
cuves qu'il faut nettoyer NH-CO-NH2) (phosphomolybdate
fréquemment) et phosphotungstate
- 1927)
Le réactif de Folin-
Formation d'un Ciocalteu réagit
Réaction avec l'Arg et,
complexe pourpre avec avec la Tyr et le Trp
Groupement dans une moindre mesure,
la liaison peptidique en et, dans une
s réactifs avec l'His, la Lys et les
présence de cuivre à moindre mesure,
acides aminés aromatiques
pH basique avec la Cys, l'His et
la liaison peptidique
595 nm (bleu de Coomassie
mesure 545 nm (ou 300 nm) 745 nm
seul : 465 nm)
Sensibilité Elevée (seuil = 1 µg) Faible (seuil = 100 µg) Elevée (seuil = 1 µg)
Méthode
moyennement
Rapidité et Méthode simple et très Méthode simple et
simple et
complexité rapide moyennement rapide
moyennement
rapide
Dosage peu influencé par la
présence d'autres Dosage fortement
Dosage influencé par
Interférence molécules sauf les influencé par les
les autres solutés
détergents et les bases autres solutés.
fortes
Forte : la protéine de
référence (l'albumine de
sérum bovin ou BSA,
Faible : la formation
"Bovine Sérum Albumine")
du complexe est à peu
Variation est une protéine globulaire
prés équivalente pour
d'une peu représentative de
toutes les protéines Forte
protéine à l'ensemble des protéines.
puisque le biuret réagit
une autre
avec la liaison
La -globuline, parfois
peptidique
employée, est une protéine
qui est une meilleure
protéine de référence.

TP4. ENZYMOLOGIE
1.- Introduction
Les enzymes représentent les outils moléculaires que les cellules utilisent pour réaliser leurs
multiples activités, c’est à dire la "vie" même. Ce sont toutes, (à l’exception notable des
ribozymes, acides nucléiques présentant une activité catalytique), des protéines, c’est à dire
des molécules codées par une partie de l’information génétique contenue dans l’ADN, par un
gène. La nature et la variété des protéines fabriquées par une cellule sont donc des caractères
génétiques et conditionnent la structure et les fonctions de cette dernière. Parmi les diverses
protéines, les enzymes assurent une fonction de catalyseurs. En présence d’une enzyme
donnée, une ou plusieurs molécules spécifiques sont amenées à interagir et à subir des
transformations chimiques déterminées. Il en résulte la formation de nouvelles substances
pouvant à leur tour être transformées par d’autres enzymes. On appelle substrats (S) les
substances réagissantes et produits (P) les substances formées.
Pour pouvoir agir sur ses substrats, une molécule d’enzyme (E) doit d’abord se lier avec eux.
Cette liaison s’établit avec une région de l’enzyme, appelée site actif, dont la configuration
spatiale est complémentaire de celle des molécules de substrats. On utilise souvent l’image de
la clef et de la serrure pour décrire cette complémentarité de forme assurant la spécificité. On
appelle complexe « enzyme-substrats » (ES) l’ensemble formé par la molécule d’enzyme et
les molécules de substrats spécifiques fixées sur elle. Le rapprochement des substrats et les
propriétés chimiques du site actif favorisent alors les interactions chimiques conduisant à la
transformation des substrats en produits. Ces derniers se détachent ensuite de la molécule
d’enzyme qui, n’ayant pas été modifiée par la réaction peut donc resservir immédiatement.

La vitesse avec laquelle les substrats se fixent à l’enzyme puis sont transformés et enfin
libérés caractérise l’activité de l’enzyme. Elle est au minimum de quelques centaines de
molécules de substrat par seconde pour une molécule d’enzyme moyennement efficace mais
peut être beaucoup plus élevée. Lorsque la comparaison entre la vitesse d’une réaction en
absence et en présence d’enzyme est possible, l’augmentation de la vitesse de réaction assurée
par l’enzyme peut atteindre quelques milliards de fois.
Pour étudier une enzyme, on l’extrait, on la purifie autant que possible puis on la fait agir in
vitro sur ses substrats pour mesurer la vitesse de réaction. Les résultats des cinétiques
permettent de comprendre le comportement des enzymes.
Ainsi, quand la concentration en enzyme est fixe et très inférieure à celle des substrats, on
observe que la vitesse de réaction est d’abord constante puis ralentit jusqu’à atteindre zéro.
Ceci s’explique en considérant les complexes enzyme-substrat qui se forment à tout moment :
tant que le substrat est en excès, toutes les molécules d’enzyme disponibles sont liées aux
substrats et les transforment à vitesse constante appelée vitesse initiale (Vi).
Lorsque les substrats s’épuisent, la probabilité de rencontre entre molécules d’enzyme et de
substrats devient de plus en plus faible, de plus en plus de molécules d’enzyme restent
inemployées et la vitesse de réaction mesurée diminue. Enfin, lorsqu’il n’y a plus de substrats,
la vitesse devient nulle.
Aussi, la valeur de Vi pour des concentrations croissantes en substrat est nulle en absence de
substrat, augmente linéairement avec l’augmentation de la concentration en substrat puis
cesse progressivement d’augmenter en tendant vers un plateau, la vitesse maximale (Vmax).
En effet, aux faibles concentrations, la probabilité de rencontre entre molécules d’enzyme et
de substrats augmente proportionnellement à la concentration de ces derniers. Si on continue à
augmenter la concentration en substrat, la probabilité de rencontre devient maximale, les
molécules d’enzyme travaillent à leur capacité maximale et Vi est donc égale à Vmax. On
qualifie pour cette raison le palier observé de plateau de saturation.
2.- Objectif
L’expérience présentée a pour but d’étudier la cinétique d’une enzyme omniprésente dans les
cellules, la catalase et de construire le graphique correspondant.
3.- Principe
La catalase décompose l’eau oxygénée (peroxyde d’hydrogène) en eau et oxygène selon la
réaction :
Catalase
2 H2O2 + →2 H2O + O2

Elle protège ainsi nos cellules des peroxydes toxiques formés lors des réactions d’oxydation.
Des carrés de papier imprégnés de catalase vont être plongés dans des solutions d’eau
oxygénée de concentrations variées. La formation de bulles d’oxygène va alors entraîner le
papier vers la surface avec une vitesse proportionnelle à la quantité d’oxygène formé,
expression de la vitesse initiale de la réaction.
4.- Matériel
- foie frais (boeuf, poulet etc…)
- un broyeur électrique
- eau oxygénée
- filtres à café
- essuie-tout
- entonnoir
- coton
- pinces à épiler
- pots de yaourt vides
- montre
5.- Préparation et mesures
1. Broyer environ 5 grammes de foie dans un quart de litre d’eau et filtrer sur un filtre à café.
Filtrer une deuxième fois dans un entonnoir en plaçant un tampon de coton au fond de
l’entonnoir. Le filtrat constitue l’extrait enzymatique.
2. Mélanger 100 ml d’eau oxygénée à 10 volumes avec 500 ml d’eau. C’est la solution stock
de substrat.
3. Découper des carrés de 1 cm x 1 cm dans un filtre à café et les mettre à tremper pendant
une minute dans l’extrait enzymatique. Les récupérer avec la pince, les poser sur un papier
essuie-tout et les retourner après une minute.
4. Placer dans un pot 100 ml de la solution stock d’eau oxygénée.
5. Saisir un des carrés de papier avec la pince et le déposer rapidement au fond du pot.
6. Chronométrer le temps nécessaire pour que le papier remonte et vienne flotter en surface
(temps t, en secondes).
7. Recommencer la même opération avec des dilutions croissantes de la solution stock tout en
conservant le même volume d’essai (90 ml d’eau oxygénée avec 10 ml d’eau, 80+20, 60+40,
40+60, 20+80, 10+90..., par exemple).
8. Ajuster éventuellement les dilutions en fonction de l’efficacité de l’extrait enzymatique qui
peut varier assez largement.
9. Construire ensuite le graphique représentant la vitesse initiale (la vitesse correspond à
l’inverse de t, soit 1/t) en fonction de la concentration en substrat (qui correspond à la fraction
de peroxyde dans la solution soit 1, 0.9, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1, dans l’exemple précédent).
Si les manipulations et les mesures ont été faites correctement, on obtient un graphique
caractéristique avec plateau de saturation. On peut alors déterminer graphiquement deux
paramètres clefs de l’enzyme : la Vmax (vitesse maximale) et le Km, concentration en
substrat donnant une Vi égale à la moitié de Vmax. Le Km caractérise l’affinité de l’enzyme
pour son substrat. Plus il est petit, plus l’enzyme est efficace puisqu’elle travaille au
maximum même si le substrat est rare dans la cellule.