Matière : Techniques d’analyses biochimiques TP n°1: Initiation au laboratoire

Promotion : L3 Biochimie & L3 Microbiologie

TP N°1 : INITIATION AU LABORATOIRE

INTRODUCTION :
L’analyse biochimique est effectuée en plusieurs étapes, où chacune d’elle nécessite l’emploi d’un
matériel approprié. Pour cela il est important de connaître les principes de fonctionnement de chaque
appareil.

I-APPAREILLAGE :
1-SPECTROPHOTOMETRE :
La spectrophotométrie nous permet de doser les molécules solubles dans les liquides biologiques.
Lorsqu’une molécule est soumise à l’influence d’un faisceau lumineux, elle absorbe grâce à son
groupement chromophore une radiation monochromatique. (Voir cours).

Seule une partie de la lumière incidente est absorbée par les molécules d’une substance dissoute donnée.
Si l’énergie lumineuse de la lumière incidente est I0 est celle de la lumière émergente est I, la loi de Beer-
Lambert indique :

Log (I / I0 ) . DO = ε.L.C
Avec :
DO = densité optique
ε = coefficient d’absorption moléculaire spécifique à la substance pour une longueur d’onde donnée ( λ )
exprimée en nanomètre (nm). Ce coefficient est exprimé en M-1cm-1.
L = Trajet de la cuve dans laquelle s’effectue la mesure. Il est égal à 1 cm (en général)
C = concentration de la solution exprimée en Mole.L-1.

A l’aide d’un spectrophotomètre d’absorption cette radiation est mesurée. Ces mesures sont effectuées à
différentes longueurs d’onde. On défini ainsi trois zones :
- la première est comprise entre 200 et 400 nm (ultraviolet),
- la seconde entre 400 et 800 nm (Visible),
- la troisième supérieure à 800 nm (infrarouge).

Les principales parties du spectrophotomètre sont :

- La source de lumineuse,
- Le monochromateur,
- Les cuvettes à échantillon d’épaisseurs variables,
- un dispositif de mesure de l’intensité lumineuse.

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1- Source lumineuse : Elle est constituée d’une lampe à tungstène fournissant des radiations lumineuses
dans le domaine du visible et de l’infrarouge (λ supérieure à 700nm) ou bien d’une lampe au deutérium
fournissant un rayonnement ultraviolet (λ inférieur à 300nm).
2- Monochromateur : Il permet de filtrer une radiation de longueur d’onde définie à partir d’un mélange
complexe de radiations lumineuses.
3- Cuve : C’est le contenant de la substance. On utilise des cuves en quartz pour des lectures en UV et
des cuves en verre pour des lectures au visible.

4- Cellule photoélectrique : Cet effet photoélectrique permet la transformation de l’énergie lumineuse en

énergie électrique.
5- Amplificateur : Le courant produit étant de très faible intensité (quelques mA) il sera amplifié.

2- CENTRIFUGATION :
C’est l’une des méthodes de séparation les plus utilisées.
Le principe se base sur l’augmentation de la force de
pesanteur par rapport à la sédimentation (voir cours).

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3-ELECTROPHORESE :
C’est aussi une méthode de séparation. Elle nous permet d’étudier le déplacement d’une molécule chargée
par rapport au liquide sous l’influence d’un champ électrique. Si la molécule est chargée positivement elle
se déplacera vers le pôle négatif (Cathode), si au contraire elle est chargée négativement elle migrera vers
le pôle positif.
Les principales parties de l’appareillage électrophorètique sont :
- un générateur de courant électrique,
- des cuves ou chambres de migration,
- des supports de migration ou plaque de
migration (Acétate de cellulose),
- un densitomètre.

4-ETUVE :
C’est un appareil qui nous permet le séchage des matériaux à
analyser (exemple : plaque d’acétate de cellulose lors de
l’électrophorèse, papier filtre lors de la chrommatographie des
glucides et des acides aminés, ...) ainsi que la verrerie utilisée au
sein du laboratoire.
Ses principales parties sont : une résistance électrique, un
thermostat, un ventilateur, une sonde de température, une chambre
de chauffage, une ouverture.

5- pH METRE :
Le pH est la mesure de l’acidité d’une solution. Il est défini comme
étant le logarithme négatif de la concentration en ions H+. Cette
mesure se fait sur une échelle allant de zéro (0) qui représente le
maximum d’acidité à quatorze (14) qui représente le maximum
d’alcalinité. La formule étant : pH=-Log (H+)
Ses principales parties sont :
- une électrode en verre qui représente la sonde de l’appareil,
- un dispositif de lecture avec des boutons de réglage ou
d’étalonnage de l’appareil.

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6- BALANCE :
C’est un appareil de précision qui nous permet d’effectuer des pesées de
l’ordre du mg ou gramme des différentes matières nécessaires à la préparation
des solutions de travail (solutions tampons par exemple).
Elle est composée :
- d’un plateau où les matières sont déposées à l’aide d’une spatule,
- d’un dispositif de mesure avec des boutons
pour le réglage des paramètres de mesure.

7- BAIN MARIE :
C’est une cuve en Plexiglas ou autre matériau dans lequel plonge un
thermomètre doté d’un thermostat. Le chauffage de l’eau est réalisé grâce à des
résistances qui plongent dans l’eau et dont la chaleur est homogénéisée grâce à
un système de mélange

II- MATERIEL DE LABORATOIRE :

En fonction de la nature des produits utilisés, le matériel de laboratoire se
subdivise en :
1- MATERIEL EN VERRE : Dans cette catégorie on regroupe principalement :
a- Bêcher : Récipient de forme cylindrique gradué du ml jusqu’au litre munis d’un bec pour les
transvasements des solutions.
b- Erlenmeyer : Récipient de forme conique, à fond plat gradué en ml.
c- Ballon à fond plat : Récipient de différentes contenances en verre ordinaire
d- Flacons jaugés : Les flacons jaugés sont généralement utilisés aux environs de 20 à 25 cl. Ils portent
un trait sur le col pour délimiter le volume indiqué.
e- pipettes : Les pipettes servent à prélever des volumes déterminés de liquide. Lors de la libération du
contenu d’une pipette il faut la tenir verticalement, il ne faut pas la secouer, il ne faut pas y souffler pour
en extraire le liquide restant dans la partie effilée car cet instrument est calibré de façon telle que le
volume indiqué correspond au volume qui s’écoule librement.
f- Burettes : Les burettes graduées sont constituées d’un tube cylindrique terminé à la partie inférieure
par un tube effilé muni d’un robinet. En général, les burettes sont graduées en dixièmes de ml, elles ont
une contenance de 5 à 50 ml, elles libèrent des gouttes d’environ 0.05 ml.
g- Eprouvettes graduées : Les éprouvettes graduées sont utilisées pour déterminer des volumes ne
nécessitant pas une grande précision.
2- MATERIEL EN POLYETHYLENE :
Le polyéthylène remplace le verre dans la fabrication de nombreux ustensiles de laboratoire (béchers,
éprouvettes, ...etc.).
Le polyéthylène résiste à l’attaque des agents chimiques tels que l’Acide fluorhydrique.

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3- MATERIEL EN PORCELAINE :
Les ustensiles en porcelaine résistent aux températures élevées, à de nombreux agents chimiques. Parmi
ces ustensiles notons les mortiers, les pilons...
4- MATERIEL EN QUARTZ :
Le quartz résiste aux températures élevées, mais il subit l’attaque des bases alcalines, des carbonates
alcalins, de l’acide fluorhydrique et de l’acide phosphorique.

Quelques exemples d’illustration du matériel de laboratoire

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