UNIVERSITE D'ALGER 1

FACULTE DES SCIENCES

Département SNV

Microbiologie Générale
TP 01
Introduction au laboratoire
de Microbiologie et les différents
procédés de stérilisation

2022
 Objectifs
1. Se familiariser avec le laboratoire de microbiologie,
son équipement et son fonctionnement.

2. S'initier à la manipulation aseptique, à l’organisation

du poste de travail et aux techniques de stérilisation.

3. Acquérir les connaissances indispensables relatives aux

risques biologiques et notamment celui lié à
la manipulation des souches microbiennes.
 Minimum de résolution

0,1mm ou
100 µm

0,1 µm

0,1 nm ou 0.001 µm

1 m = 103 mm ; 1 mm = 103 μm ; 1 μm = 103 nm

 Définitions
- Microbiologie « Micro » : petit , « Bio » : vie,
logie : science. c’est l’étude des
Colonie êtres vivants invisibles
Souche

à l’œil nu et qui doivent être observés, examinés

et étudiés sous le microscope.
-Germes : microorganismes (bactéries, levures,
parasites…)
- Colonie : Amas de bactéries qui se forme par multiplication, à partir
d’une bactérie souche, sur un milieu de culture et reconnaissable par
son aspect, sa consistance et sa couleur. Une colonie bactérienne est
visible à l’œil nu lorsqu’elle est composée de plusieurs milliards
d’éléments.
- Souche : ensemble clones bactériens ayant la même origine
(descend d'un seul microorganisme et de la même culture
pure).
 Présentation du laboratoire
de microbiologie

Le laboratoire de microbiologie doit être composé

de trois parties principales :

●Le laboratoire proprement dit où sont réalisées

les analyses.
● La salle de préparation des milieux de culture.
●La laverie qui traite les produits et matériels
utilisés pour l’analyse et qui fournit la verrerie
et le matériel propre et stérile.
 Organisation du laboratoire d’analyse
• Le laboratoire doit être conçu de manière à assurer partout une
bonne ventilation grâce à un système de ventilation actif.
• Les pièces doivent avoir un plafond haut pour assurer
une ventilation correcte sans courant d’air.
• les murs et les plafonds doivent être peints avec une peinture
brillante et lavable ou recouverts d’une matière qui puisse être
lavée et désinfectée.
• Surface des paillasses imperméable et résistante aux solvants et
aux acides, facilement désinfectée.
• Le sol doit être facilement lavable.
 Organisation du laboratoire d’analyse
• Le laboratoire doit être assez spacieux pour permettre
une bonne circulation des personnes.
• Il doit être bien éclairé et équipé d’une hotte de sécurité
microbiologique.

1. Avoir des armoires pour stocker la verrerie, le matériel jetable,

les milieux déshydratés et certains produits chimiques.
2. Avoir une armoire frigorifique pour la conservation des milieux
prêts à l’emploi et des souches bactériennes.
1 2
 Matériel de sécurité

• Equipement de protection individuelle (EPI).

• Les extincteurs et couvertures anti-feu.

• Des lieux de stockage approprié et des armoires

spécifiques pour les produits inflammables et les
produits chimiques toxiques.
 Matériel de sécurité

• Une station de lavage oculaire.

• Fournitures et consommables
pour l’élimination des déchets à
risque infectieux.

• Kit de premières urgences.

Les risques au laboratoire
de microbiologie
 Matériels et Appareillage
utilisés dans un laboratoire
de microbiologie
 En commençant par chauffer la partie
moyenne de l'instrument
Anse (oese) de platine
L’anse de platine est composée
d’un fil de platine terminé par une boucle
fermée et monté sur un manche métallique
destiné à prélever une culture de micro-
organismes en vue d’un repiquage ou d’un
frottis.
Pipettes Pasteur en verre cotonnées ou non

Les pipettes Pasteur stériles sont des

tubes fins généralement en verre dont
l'extrémité est effilée. Les pipettes se
terminent soit par une pointe ouverte (à
usage unique), elles sont dans ce cas
utiles pour prélever des petits volumes d'un
liquide. Ou bien une pointe fermée (pipette
boutonnée) utile pour le transfert des
microorganismes (ensemencement).

Pipettes Pasteur
en plastique
Pipettes Pasteur en verre

Rateau ou Étaloir
Pipettes chimiques graduées
 Poires
à pipeter
Pipeteurs
manuels
Pipeteur automatique
 Ecouvillons en tube plastique Pissete
Recueil des prélèvements bactériologiques

Une pissette est un récipient de laboratoire, de forme cylindrique (souvent en matière

plastique souple), munie d'un tube plongeant et d'un tube verseur recourbé.
La pissette est prévue pour contenir des solvants divers (éthanol, méthanol,
eau déminéralisée, etc.). Elle est habituellement utilisée pour le rinçage de la vaisselle

de laboratoire par un petit jet liquide.(tubes à essai, ...).

Boite de Petri
Boitesende
plastique
Petri en àverre
usage unique
Une boîte de Petri est une boîte transparente peu profonde, en verre ou en plastique,
munie d'un couvercle. Utilisées pour la mise en culture de micro-organismes
 Il est constitué d'une base conique et d'un col
cylindrique, peut être bouché par un bouchon
Le bécher est généralement constitué afin d'agiter un mélange, de conserver
d'un cylindre vertical gradué, à fond plat, une solution ou de limiter l'évaporation.
au bord haut légèrement évasé et muni
d'un bec verseur. Chauffage et dosage
des solutions…

Bechers Erlenmeyer
 Eprouvette graduée
L'éprouvette graduée est un récipient utilisé
en laboratoire pour mesurer des volumes des liquides.
Tubes à centrifuger
Les microtubes sont de petits tubes munis d'un capuchon à visser ou à clipser. Ils sont
en matière plastique, le polypropylène, capable de résister aux hautes températures ,
aux basses températures ou aux solvants organiques. pour stocker un échantillon (ADN…)

Microtubes à centrifuger (tubes Eppendorf)

Tubes à essai
Portoir (porte-tube)
Portoir pour boites de Petri
Les micropipettes permettent de prélever et de transférer des volumes très faibles
de liquide avec une grande précision.

Micropipettes
Micropipette multicanaux
Une plaque 96 puits est une plaque de plastique contenant des puits (alignés en 8
rangées x 12 colonnes). Utilisée pour des réactions à analyser par PCR, ELISA…

Microplaque
Pinces
Spatules
Le mortier est un récipient permettant de broyer des matières que l'on veut
transformer en pâte ou en poudre grâce à l'action d'un pilon.

Mortier et Pilon
Balances de précision
pour un pesage précis.
Agitateur
vortex
 Agitateur
magnétique
non chauffant
Agitateur à plate-forme
Plaque chauffante Plaque chauffante
à agitateur
pH mètre
 Densitomètre Mesures en unités McFarland

Principe: mesure de la concentration de cellules (bactéries et levures)

Mesure de la turbidité de suspension cellulaire fonctionnement basé sur la mesure
de la densité optique.
Les bain-maries sont des équipements de laboratoire permettant de chauffer
un récipient dans un bain d'eau ou d'huile (en fonction de la température souhaitée).

Bain marie
numérique
Ce type d'appareil peut aussi servir à séparer des constituants de taille et de masse très
variables contenus dans un liquide.

Centrifugeuse des tubes

Eppendorf

Microcentrifugeuse
Centrifugeuse
Une hotte de laboratoire est un dispositif qui
permet l'extraction des vapeurs toxiques des
produits utilisés lors de manipulations. Sa fonction
première est de protéger le manipulateur, mais
aussi la manipulation et l’environnement.

Poste de sécurité microbiologique

(hotte microbiologique)
Les vapeurs sont extraites du volume de travail puis,

soit traitées par une filtration soit rejetées vers

l'extérieur.

Hotte biologique ou Poste de Sécurité Microbiologique (PSM)

 En produisant une flamme continue de couleur bleue, voire incolore (à la lumière du Soleil),
et dont la température peut facilement atteindre 1 200 °C, voire 1 500 °C.

10-15 cm

10-15 cm 10-15 cm

Bec Bunsen à gaz

Il est à noter que le bec Bunsen, réglé avec une flamme bleue, la plus chaude, crée une
zone de stérilité d'un diamètre d'environ 20 cm. Toutes les manipulations d'ouverture de
tubes
Un et
becboîtes
Bunsendeest
culture, d'ensemencement,
un appareil devrontàêtre
de laboratoire destiné réalisées
produire dans ce
une flamme diamètre.
ouverte
Pour quegaz
avec du cette zone soitafin
combustible effectivement stérile,
de chauffer des les courants
préparations, d'airdu
stériliser et matériel
déplacements de
ou brûler
personnes sont à proscrire. des substances.
Réfrigérateur
pour la conservation des
microorganismes et produits sensibles
 L'azote liquide correspond au gaz diazote refroidi en dessous de son point d'ébullition
à −195,79 °C. Il a l'apparence d'un liquide limpide, d'où s'échappent des vapeurs blanches.

Conservation
de souches microbiennes dans

L’AZOTE LIQUIDE
 Jarres pour anaérobiose

Un système fiable pour l'isolement et la culture en anaérobiose de micro-organismes.

 Compteur des colonies

Des comptages fiables et efficaces : de colonies de bactéries sur boîtes de Petri

Microscope
monoculaire
Microscope
binoculaire
 Microscope
Microscopeà
électronique
électronique à
transmission
balayage
Organisation de la paillasse au laboratoire de microbiologie
 Étuve bactériologique
Étuve bactériologique : Max 70°C

Utilisée pour les cultures microbiennes

L’étuve de laboratoire est utilisée principalement pour effectuer, à une température

donnée, la culture in vitro de microorganismes (bactéries, champignons tels que
dermatophytes, moisissures et levures, …).

La température la plus fréquemment utilisée se situe aux alentours de 37°C

(température pour une croissance optimale des microorganismes) mais l’étuve peut
également s’utiliser à d’autres températures.
 Étuve
L’Étuve bactériologique
 Étuve
programmable
Incubateur-Agitateur
Matériels de stérilisation
La stérilisation est l’opération qui a pour objet de tuer tous
les microorganismes contenus dans une préparation.
Le matériel traité est dit stérile lorsque le résultat est acquis, c.à.d.
lorsque aucun microorganisme n’est revivifiable ou capable de se
développer.
La stérilisation doit toujours être considérée par rapport aux points
suivants:
 Nature des milieux de culture
 Taille de l’échantillon
 Condition de température
 Durée de stérilisation
 Mort d’une bactérie = L’inactivation de celle-ci
 Perte irréversible de son pouvoir de reproduction (croissance et division )
Les agents utilisés pour assurer une stérilisation sont :
 Physiques ( température, radiation );
 Chimiques .
NB: Ne pas confondre stérilisation et désinfection/décontamination.
La désinfection se rapproche énormément de la stérilisation.
Mais la grande différence entre les deux réside le fait que le processus de la désinfection est
moins mortel que la stérilisation pour les micro-organismes et les spores.
La stérilisation est une opération qui vise à tuer les micro organismes ainsi que les virus et
les spores bactériennes.

L’efficacité de tous les procédé de stérilisation dépend de la propreté initiale de l’objet à

stériliser, donc de sa préparation.
 LE FLAMBAGE

Il est basé sur l'emploi du bec Bunsen.

Cette méthode est utilisée pour la stérilisation extemporanée (pour

utilisation immédiate) du matériel de manipulation : extrémité de l'öse,
extérieur des pipettes Pasteur et pipettes graduées, col des tubes à essai,
tubes contenant des milieux de culture, erlenmeyers et flacons divers,
étaloirs ...
 L’autoclave
(stérilisation à la chaleur humide
= Vapeur d’eau comprimée)
 Autoclavage
• L'autoclave est utilisé pour la stérilisation
par traitement thermique à la vapeur d'eau. En d'autres termes, l'autoclave est
un récipient qui se ferme hermétiquement afin d'augmenter la pression. Cette
réaction permet logiquement de faire grimper la température pour atteindre
un niveau de stérilisation efficace.

C'est un appareil très performant qui est indispensable dans une unité de
microbiologie. Il est utilisé pour stériliser les milieux de culture neufs ou souillés,
mais peut également stériliser tout autre matériel de microbiologie.

Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d'eau, à une température de 100° à

130°C, pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée
et du volume des récipients (généralement durant 20 min).

En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des

températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec.
 Le matériel à stériliser est déposé dans les paniers métalliques de l'autoclave dont on aura vérifié le
niveau d'eau avant chaque opération de stérilisation. Les récipients sont préalablement bouchés avec du
coton (éviter de le prendre avec les doigts - utiliser de préférence une pince).
 Autoclave
automatique
 Four Pasteur
Four Pasteur souvent dit « Poupinel » :

Utilisée pour la stérilisation du matériel (à la chaleur sèche)

à une température supérieure de jusqu’à 250°C

C'est un four électrique à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la
verrerie vide (tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes
Pasteur et récipients divers) ou des instruments chirurgicaux ou matériels
métalliques..
La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement
bouchée avec du coton cardé. Emballer le matériel dans du papier aluminium ou dans
des sacs de stérilisation. Le matériel est alors disposée à l'intérieur du four et subit un
chauffage de 180 degré pendant 30 minutes, si 4 heures à 140 °C ; si 2 heures 30 à
160°C …
Four Pasteur
 Matériel de filtration
 La filtration est un procédé de choix qui offre
d’excellentes garanties quant à la rétention
absolue des microorganismes.
Filtration
 Pour stériliser soit des gazs (hotte
microbiologique) ou des solution (liquides)
renfermant des substances thermosensibles
telles que les protéines.
 Stérilisation filtrante = Stérilisation à froid
 Le dispositif
de filtration

La filtration est un procédés de stérilisation permettant de

séparer les constituants d'un mélange à travers d’un filtre
(membrane perforée par des pores calibrés)

En bactériologie, on utilise surtout les filtres de 47 mm de diamètre dont les pores 0.45 µm à 0.22 µm
de diamètre retiennent à peu près tous les microorganismes en dehors des virus.
La filtration

Remplissage
 Filtration sur membrane

Transfert de la membrane filtrante sur un milieu de culture approprié

 Rampe de Filtration

Possibilité de mettre en série plusieurs filtrations en même temps

 La stérilisation:
-Des dispositifs médicaux
-Les produits de pharmacie
-Les articles cosmétiques
-Des matériaux d’emballage

Boites d’irradiation
Afin de tuer les micro-organismes.
 Boite d’irradiation
Une caractéristique clé de l’irradiation X et gamma est la capacité élevée
de pénétration. Celle-ci permet à des produits modérément denses ou emballés d’être
traités avec une aisance relative et facilite le traitement des produits palettisés.
 EFFET DU RAYONNEMENT UV

La désinfection par la lumière UV inactive les organismes pathogènes (les bactéries,

les virus et les protozoaires) par la dégradation de leurs acides nucléiques.
 La pasteurisation est un procédé de
conservation des aliments (exemple: Lait);
 Ces derniers sont chauffés à une température
définie, pendant une durée bien déterminée,
La pasteurisation
puis refroidis rapidement;
 Les températures de pasteurisation varient
entre 62 °C et 88 °C.
 Les températures sont basses pour éviter
d’altérer la qualité organoleptique des
aliments (notamment la destruction des
protéines et sucres);
 La pasteurisation réduit de manière
significative la flore microbienne des
aliments, mais certaines formes de résistance
persistent, telles que les spores.
La tyndallisation
 La tyndallisation est un procédé de stérilisation
modérée qui permet d'éliminer du milieu les formes
de résistance (les spores).

 Le milieu est soumis à un chauffage discontinu: on

chauffe soit 80 °C pendant 1 h ou 100 °C pendant 30
min, toutes les 24h pendant trois jours successifs.
 Ce traitement thermique inactive toutes les formes
végétatives mais n’inactive pas les spores. Les spores qui
survivent vont germiner en formes végétatives durant une
incubation à température appropriée pendant 24h puis
exposés de nouveau à 100 °C pd 30 min. Ce cycle est répété
3 fois.
 Donc on élimine progressivement toutes les spores du
milieu.
 Applications: contrôle microbiologique des aliments
et stérilisation des milieux de culture thermosensibles.
 La stérilisation

Un objet stérile est totalement dépourvu de microorganismes et

de spores.

En microbiologie, le but de la stérilisation est de:

• Maîtriser les microorganismes introduits dans le milieu

d'étude.

• Eviter la contamination du milieu extérieur et des

personnes.
 - Désinfection : Opération permettant de tuer ou d’inactiver momentanément
les microorganismes. La désinfection est valable seulement au moment où elle
est pratiquée. Elle ne reste active que dans un laps de temps relativement court.
Lorsqu'on utilise un désinfectant, on n’obtient pas toujours l'élimination
totale des microorganismes car les spores et quelques microorganismes
peuvent résister.

- Décontamination :La décontamination est une opération destinée à éliminer

les contaminants (biologique ou chimique), ou à en réduire le nombre sur des tissus
vivants et sur des objets inertes à des taux considérés comme sans danger, de
manière à respecter les normes d'hygiène et de santé publique. C’est une étape
préalable à la stérilisation ou la désinfection.
Exemple : décontamination des sols, murs, plafonds et paillasses du laboratoire
avec produits de nettoyages, des agents de décontamination utilisés dans les
industries agroalimentaires.
 - Antisepsie : est une opération au résultat momentané permettant d'éliminer
ou d’inhiber les micro-organismes au niveau des tissus vivants
par application d'un produit antiseptique qui sont des agents chimiques
à toxicité sélective.

- L'asepsie : consiste à empêcher la contamination d'une zone ou d'une surface

par des micro-organismes étrangers (bactéries, parasites...). L'asepsie consiste
en la décontamination de l'espace de manipulation, y compris de l'air, du matériel,
et l'utilisation d' antiseptiques sur la surface du corps.
A. La stérilisation par les méthodes physiques
B. La stérilisation par les méthodes chimiques
 Tout matériel biologique (bactéries, champignons, levures,
sang, liquides,…) doit être considéré comme potentiellement
dangereux.

Mesures de sécurité
Les BONNES PRATIQUES en Laboratoire de
Microbiologie

Il faut prendre de précautions pour éviter de:

 Contaminer une souche;
 Etre contaminé par une souche;
 Contaminer l’environnement.
Les Règles d’hygiène et de sécurité à respecter
dans un laboratoire de microbiologie
 Consignes avant les TPs Justification
Passer aux vestiaires (hors du laboratoire)
où vêtements de Ville et de travail sont séparés Eviter la contamination microbienne

Mettre une blouse en coton avec des manches Lavable, ininflammable, éviter
longues les accidents avec les acides et les bases.
Boutonner la blouse pour protéger les avant-bras Protection efficace y compris des avant-
reposant sur la paillasse. bras
Pour éviter de se faire brû ler par
Attacher les cheveux la flamme du Bec Bunsen
Sensibles aux produits chimiques
Enlever les bijoux et vecteurs de contaminations
Source de contamination par les
Fermer les portes et les fenêtres du laboratoire courants d’air (apport
de microorganismes)

Se laver les mains avec un savon désinfectant

liquide de préférence , Les ongles doivent être Destruction des microorganismes
courts. Procéder à un lavage minutieux des mains,
avec brossage des ongles avant les manipulations.

Ne pas toucher les flacons de produits chimiques

avant de lire les précautions d’emploi Produits dangereux
 Consignes pendant les TPs Justification
Avoir un plan de travail net et bien organisé Travail plus sû r et plus facile
Ne laisser sur le poste de travail que le matériel nécessaire
à la manipulation Eviter l’encombrement
Eviter les gestes brusques et inutiles (disposer le matériel Eviter les accidents de travail
et les cultures de manière à travailler efficacement)
Risque microorganismes très
Travail sous hotte microbiologique ou chimique pathogènes et des produits
toxiques ou volatiles
Meilleure position de
Travail assis devant le bec bunsen allumé (flamme bleue) manipulation

Flamber, avant et après la manipulation, les anses de afin de dessécher les restes de
platine utilisées pour les prélèvements, en commençant culture avant de porter
par chauffer la partie moyenne de l'instrument l'extrémité dans la flamme, ceci
pour éviter toute projection
Eviter le contact des produits avec la peau, la bouche,
les yeux Parfois très toxiques
Risque d’absorption de
Le pipetage à la bouche est interdit (utiliser les poires microorganismes ou de produits
d’aspiration ou les propipettes) chimiques
Refermer les flacons de tout produit après son utilisation Vapeurs parfois toxiques ; risque
de renversement
 Consignes pendant les TPs Justification
Si des cultures sont renversées, nettoyer rapidement le Désinfection du lieu
lieu de l’accident de l’accident (eau de javel 12°/
alcool 70°)
Après utilisation mettre lames, lamelles et pipettes à Destruction
tremper dans de l’eau javellisée (1 verre à 12° des microorganismes
chlorométriques pour 2l d’eau)

Etiqueter les produits et les préparations Eviter le risque de mélange de

produits

Ne pas porter les mains à la bouche

Ne pas toucher des objets personnels

Ne pas serrer la main des visiteurs Eviter la contamination

microbienne et sa propagation
Il est interdit de fumer, de boire et de manger

Il est interdit de téléphoner et même, dans certains cas,

de parler au personnel du laboratoire lors de
manipulations
 Consignes après les TPs Justification
Risque de contamination
Autoclaver les cultures à détruire avant de les jeter du personnel et de
l’environnement

Laver le matériel (désinfecter si cela n’a pas déjà été fait

par trempage dans l’eau javellisée) et ranger

Laver le plan de travail puis le pulvériser d’eau javellisée Destruction des

et essuyer au papier absorbant microorganismes

Se laver les mains avec produits désinfectant et les essuyer

avec une serviette à usage unique.

Laver la blouse (séparément du linge familial) à et la Eviter de contaminer le linge

javelliser familial

Destruction efficace des

Repasser à fer fort microorganismes

Veuillez préserver l’hygiène du

laboratoire
préparations