Introduction

La microbiologie est la science qui étudie les micro-

organismes. soit:

Certains eucaryotes
Champignons et certaines algues.
Protozoaires (êtres unicellulaires animaux).

Tous les procaryotes

Cyanophycées ou algues bleues .
Bactéries.

Les Virus
Les virus ne sont pas des micro-organismes car ils ne sont pas
autonomes, ils ne peuvent pas se reproduire sans détourner la
machinerie cellulaire d'un autre individu.
 La microscopie
La microscopie est un ensemble de techniques
permettant d'obtenir une image des structures biologiques.

Le principe est dans tous les cas le même : une onde est
envoyée sur la préparation ou émise par la préparation.

Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands

groupes, différents par la nature de la particule
élémentaire impliquée :

Le microscope optique
Le microscope électronique
 1. La microscopie optique
Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Hans
et Zacharias Janssen, deux fabricants de lentilles
néerlandais, en 1590, mais le modèle final fut inventé par
Antoine van Leeuwenhœk en 1664, puis fut amélioré
par Christian Huygens.

La microscopie optique regroupe:

Le microscope à fond clair

Le microscope à fond noir
Le microscope à contraste de phase
Le microscope à fluorescence
 1-1. La microscopie à fond clair

Utilise des les rayons lumineux.

Permet le grossissement de 1500-2000 fois.

Épaisseur de coupe ( 1-5 µm).

Observation vitale et colorée.

 Bactérie

Microscope à fond clair Paramécie

1-2. La microscopie en contraste de phase
Cette technique permet d'observer les cellules sans
préparation ni coloration dans leur milieu d'origine.

Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques

sont transparentes (n’absorbe pas la lumière transmise).

Nécessite un éclairage très précis dite éclairage de Koehler.

A l’observation, on voit une image en noir et blanc où les

différentes structures apparaissent bordées de blanc d’un
côté et de noir de l’autre.
Culture cellulaire
 1-3. La microscopie à fond noir

Utilise les rayons lumineux dans un fond noir.

Les zones de la préparation qui diffusent la lumière

apparaissent lumineuses ( claires ) sur ce fond noir.

Utilisé pour les éléments trop transparents.

Les éléments observés apparaissent très brillants

( les flagelles, les fibres ).

N'est pas utilisé pour l'observation d'objets colorés.

 Bulles d'air dans l'eau

Le microscope à fond noir

 1-4. La Microscopie à fluorescence

Cette technique est utilisées pour

certaines molécules qui émettent de
la lumière quand on les éclaire avec
une lumière de longueur d'onde
supérieure.

On éclaire l'échantillon avec une

lumière ultraviolette, violette ou
bleue.

Consiste à utiliser une coloration fluorescente. Deux

colorants très utilisés sont : la rhodamine (émet une lumière
rouge) et la fluorescéine (lumière verte).
 Culture cellulaire

Le microscope à fluorescence Legionella pneumophila

 2. La microscopie électronique

Il existe deux variantes de la microscopie

électronique :

La microscopie à transmission

La microscopie à balayage
 2-1. La microscopie électronique à transmission

Utilise comme rayonnement des électrons.

Observation sous ultravide.

Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

Les échantillons sont sous forme de lames extrêmement fines ( 50

nanomètre ).

L'image obtenue peut être vue sur un écran.

L'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le

nom de coloration négative. L'échantillon apparaît blanc sur un fond
sombre.
Le microscope électronique Bactériophage
à transmission
 2-2. La Microscopie électronique à balayage

Utilise des électrons.

Observation sous ultravide.

Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

Fournis des images en 3D.

Permet l’observation des coupes d’une épaisseur

de 300 – 600 A°.
Le microscope électronique Bifidobacterium adolescentis
à balayage
 Définition
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les
micro-organismes d'un objet, et de manière durable.

En microbiologie, le but de la stérilisation est:

D'une part de maîtriser les micro-organismes introduits
dans le milieu d'étude.
D'autre part d'éviter la contamination du milieu
extérieur et des personnes.

Le choix d’une méthode de stérilisation est en fonction

de:
La nature de la substance ou l’objet à stériliser.
Sa pollution présumée.
L’équipement disponible au laboratoire.
 La stérilisation peut être réalisée par:
1. Des procédés physiques:
Stérilisation par la chaleur
Chaleur sèche
Chaleur humide
Pasteurisation
Tyndallisation
Stérilisation par filtration
Stérilisation par radiations

2. Des procédés chimiques:

Antiseptiques
Désinfectants
Antibiotiques
 I. La chaleur
1. Chaleur sèche

Bec Bunsen (chauffage direct):

Crée un globe virtuel stérile de 10 cm de rayon de la
flamme.
A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes
de verre...), pour certains objets en métal (anse , pince).

Fours Pasteur, Poupinel ( stérilisateurs à air chaud ):

C'est un four classique utilisé pour la verrerie,
porcelaine et instruments métalliques.

Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par

un chauffage de : 4 heures à 140 °C ; 2 heures à 160°C ;
30 min à 180°C.
Bec bunsen Four Pasteur
2. Chaleur humide

2-1. Autoclavage:
Cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans
une enceinte close pour augmenter la pression et donc
dépasser les 100°C d‘ébullition. Ceci est réalisé à
121°C pendant 15 minutes au minimum.
A utiliser pour les milieux de culture, matériel en
caoutchouc, la verrerie…

2-2. Les bain-marie ou bain- thermo statés ( ébullition ):

Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou
un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit à
détruire toutes les formes végétatives.
A utiliser pour la stérilisation des produits liquides
délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions
concentrées de glucides, ...
Autoclave Bain marie
2-3. Pasteurisation:
Conservation des produits naturels pendant un temps
limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas
les spores.
Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s,
par exemple,puis on le refroidit brusquement à 10°C.
Conservation des produits alimentaires.
2-4. Tyndallisation:
La tyndallisation est une série de chauffages brefs à
des températures de 70°C à intervalles réguliers
(3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2
chauffages), ceci afin de laisser aux formes résistantes
la possibilité de germer pour les tuer au chauffage
suivant.
Utilisation très limitée aux substances thermolabiles
non filtrables (émulsion de jaune d'oeuf, vaccins),
préparation de milieux à base de sérum ou de jaune
d'oeuf.
 2. Stérilisation par filtration
La filtration consiste à faire passer le liquide à stériliser à
travers une paroi poreuse ou une membrane qui retient les
bactéries.
Il existe plusieurs types de filtration:
Les bougies de type Chamberland: tubes à fond arrondi
dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension
de ces pores varie de quelques µm au 1/10ème de µm.
Disques: disques en verre fritté de porosité de 150 à 1
µm.
Membranes: membranes plastiques minces comportant
des millions de pores par cm2 dont la taille, très uniforme,
varie de 8 à 0.01 µm.
Stériliser des liquides altérables par la chaleur: sérums,
solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines
Différents filtres
 3. Stérilisation par radiations

C'est la lumière U.V qui est la plus souvent utilisée

( lampes germicides ou stérilampes ).

Stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des

locaux ou des hottes, servant aux manipulations en
atmosphère stérile.

Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation

et conditionnement des produits pharmaceutiques,
ensemencements bactériens, préparation de milieux.

Les rayons X ou y sont utilisés pour la conservation de

certains produits alimentaires.
3-1. Antiseptiques:
Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres.
Leur action est instantanée. ex: teinture
d'iode, permanganate de potassium, eau oxygénée ...
Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des
plaies et des muqueuses.
3-2. Désinfectants:
Empêche les contaminations humaines et animales.
Vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )
Liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel )
Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme: eau,
air, sol .
3-3. Antibiotiques:
Les antibiotiques bactériostatiques: stoppent
la multiplication des bactéries sans les détruire.
Les antibiotiques bactéricides: qui tuent les bactéries
Utilisation in vivo.
Pipette graduées Pipette jaugées Pipette pasteur
Ballon Becher

Erlenmeyer Éprouvette

Verre à pied Fiole

Cristallisoir Flacon

Boite de
pétri Entonnoir

Dessiccateur Tube à essai