DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM

COLORATION AU GIEMSA DES

ÉTALEMENTS DE SANG À LA
RECHERCHE DE PLASMODIUM

DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME

MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS ­– DMP-MON-07A

1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION

Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour une coloration de Giemsa correcte des
étalements de sang.
Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance
de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont
obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de
référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des
établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme.

2. HISTORIQUE
Un étalement correctement coloré est indispensable si l’on veut pouvoir poser un diagnostic du paludisme,
en particulier si l’on veut identifier avec précision différentes espèces parasitaires. Il est recommandé
d’utiliser le colorant de Giemsa pour la coloration de frottis minces et de gouttes épaisses ; c’est également
la procédure jugée comme étant la plus fiable. La solution de Giemsa est un mélange d’éosine et de bleu
de méthylène (azur). L’éosine colore la chromatine du parasite en rouge, tandis que le bleu de méthylène
colore le cytoplasme parasitaire en bleu. On utilise du méthanol pour fixer le frottis mince. L’hémolyse et
la coloration de la goutte épaisse ont lieu simultanément. Le pH idéal pour faire ressortir les granulations
liées aux parasites et identifier différentes espèces est à 7,2.

Méthodes de coloration
Il y a deux méthodes de coloration avec le Giemsa : la méthode rapide (solution de travail à 10 %) et la
méthode lente (solution de travail à 3 %).

La méthode rapide (solution de travail à 10 %)

C’est la méthode la plus courante pour colorer simultanément de 1 à 15 lames. On utilise la méthode
rapide dans les dispensaires et les laboratoires très fréquentés, où la rapidité du diagnostic est un élément
essentiel des soins aux patients. Cette méthode est efficace, mais demande plus de colorant. L’obligation
d’aller vite justifie le coût supplémentaire.

La méthode lente (solution de travail à 3 %)

Cette méthode convient pour colorer un grand nombre de lames (20 ou plus). Elle est idéale pour la
coloration des étalements dans le cadre d’enquêtes transversales ou épidémiologiques, de travaux de
recherche ou de lots pour l’enseignement. Cette méthode convient moins bien lorsqu’on a besoin d’un
résultat rapide. Elle est moins coûteuse que la méthode rapide car on utilise beaucoup moins de colorant
(concentration à 3 % au lieu de 10 %).

1
DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM

3. CONSOMMABLES ET ÉQUIPEMENTS
Pour la méthode rapide (solution de travail à 10 %)
• du colorant de Giemsa (solution à 10 %) (voir DMP-MON-04 pour le mode de préparation) ;
• un petit récipient ou bécher pour le colorant de Giemsa ;
• du méthanol absolu et sans acétone ;
• une pipette de Pasteur munie d’une poire ;
• un petit récipient ou bécher pour le méthanol ;
• une cuve, un plateau ou un support de coloration en plastique ;
• un chronomètre (minuterie) ;
• un égouttoir (ou râtelier) pour le séchage des lames ;
• un petit sèche-cheveux électrique ;
• des gants de protection en latex sans talc, jetables ; et
• de l’eau distillée ou déionisée, tamponnée à pH 7,2.

Pour la méthode lente (solution de travail à 3 %)

• du colorant de Giemsa (solution à 3 %) (voir DMP-MON-04 pour le mode de préparation) ;
• un petit récipient ou bécher pour le colorant de Giemsa ;
• du méthanol absolu et sans acétone ;
• une pipette de Pasteur munie d’une poire ;
• un petit récipient ou bécher pour le méthanol ;
• des cuves à coloration, pouvant contenir 20 lames dos à dos ;
• un chronomètre (minuterie) ;
• un égouttoir (ou râtelier) pour le séchage des lames ;
• des gants de protection en latex sans talc, jetables ; et
• de l’eau distillée ou déionisée, tamponnée à pH 7,2.

4. CONSIGNES DE SÉCURITÉ
1. Le méthanol (alcool méthylique) est inflammable et très toxique en cas d’ingestion ou d’inhalation ;
quelle que soit la quantité absorbée, il peut provoquer la cécité, voire la mort. Évitez tout contact et
inhalation. Quand on ne l’utilise pas, il doit être conservé dans une armoire fermée à clé.
2. Les précautions universelles doivent être observées – y compris pour ce qui est de l’utilisation
d’équipements de protection individuelle adéquats comme les gants, les lunettes de protection et la
blouse de laboratoire. Voir DMP-MON-11 : Procédures générales de sécurité dans le laboratoire de
diagnostic microscopique du paludisme.

2
DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM
5. PROCÉDURE
SCHÉMA
Pour la méthode rapide (10 %)
1.  Préparez
une solution de
travail Giemsa à 10 % (DMP-
MON-04) et versez-la dans
un petit récipient.
2.  Fixez le frottis en déposant
avec précaution du méthanol
sur l’étalement uniquement à
l’aide d’une pipette de Pasteur.
3.  Laissez les lames sécher à
l’air sur le râtelier ou l’égouttoir.
4.  Mettez les lames à colorer
face vers le bas dans une cuve de
coloration incurvée ou face vers
le haut sur un plateau ou un bac.
5.  Versez délicatement la
solution de colorant sur ou
sous la lame jusqu’à ce que les
étalements soient recouverts.
6.  Réglez la minuterie pour
que les étalements restent
en contact avec le colorant
pendant 8 à 10 minutes.
7.  Éliminez doucement le
colorant de la lame en ajoutant
goutte à goutte de l’eau propre.
8.  Laissez les lames sécher à l’air.
9.  Jetez
la solution de Giemsa à
10 % restante.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
Pour la méthode rapide (10 %)
1. Estimez le volume de solution de travail Giemsa à 10 %
dont vous aurez besoin pour le nombre de lames à colorer.
Vous aurez besoin d’environ 3 ml de colorant par lame
à recouvrir. Préparez le colorant juste avant de l’utiliser,
conformément au DMP-MON-04 : Préparation d’une
solution de travail Giemsa.
2. Pour fixer le frottis, utilisez de préférence une pipette de
Pasteur ou faites-le tremper deux secondes dans un petit
récipient ou un bécher contenant du méthanol. Évitez
tout contact entre la goutte épaisse et le méthanol ou ses
émanations, qui la fixeraient rapidement et entraverait
l’hémolyse de la goutte épaisse.
3. Mettez les lames sur un râtelier ou un égouttoir. Laissez les
frottis fixés au méthanol sécher complètement à l’air (durant
environ 2 minutes) en plaçant les lames sur une surface
plane. Ne laissez jamais les lames sécher à la verticale
avec le frottis vers le bas, les émanations du méthanol
risqueraient de fixer la goutte épaisse.
4. Mettez les lames à colorer face vers le bas si vous utilisez
une cuve de coloration incurvée ou face vers le haut sur un
plateau ou un bac.
5. Versez délicatement la solution de colorant entre la lame
et la cuve de coloration jusqu’à ce que chaque lame
soit recouverte si la lame est face vers le bas ou versez
délicatement le colorant sur les lames face vers le haut si
vous utilisez un plateau ou un bac.
6. Réglez la minuterie sur 8–10 minutes (la durée de coloration
devrait être définie à un stade antérieur en testant le lot de
solution mère utilisé), et laissez le colorant agir sur les lames.
Avec l’expérience, vous saurez le temps exact qui convient
pour obtenir une bonne coloration. Voir DMP-MON 3c :
Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de
l’eau tamponnée.
7. À la fin du temps de coloration, retirez chaque lame une
à une. Éliminez doucement le colorant de la lame en
ajoutant goutte à goutte la solution d’eau tamponnée,
jusqu’à ce qu’il ne reste plus de colorant. Ne jetez pas le
colorant en renversant directement les lames car, dans ce
cas, la pellicule d’un vert métallique à la surface du liquide
adhérerait à l’étalement de sang et empêcherait l’examen
au microscope.
8. Une fois le colorant éliminé, mettez les lames sur le râtelier
pour les égoutter et les faire sécher, la face portant les
étalements vers le bas, ou en position verticale avec la
goutte épaisse vers le bas. Veillez à ce que les bords de
l’égouttoir n’arrachent pas des lambeaux de goutte épaisse.
9. Jetez la solution de Giemsa à 10 % restante.
3
DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM
SCHÉMA
Pour la méthode lente (à 3 %)
1.  Préparez
une solution de travail
Giemsa à 3 % (DMP-MON-04)
et versez-la dans un
petit récipient.
2.  Ne fixez que le frottis mince
avec le méthanol. Évitez tout
contact entre la goutte épaisse
et le méthanol pour éviter une
fixation intempestive.
3.  Laissez sécher les étalements
de sang à l’air sur un égouttoir
ou un râtelier.
4.  Mettez les lames dos à dos
dans la cuve de coloration.
5.  Versez délicatement le
colorant sur les lames. Ne le
versez pas directement sur les
gouttes épaisses.
6.  Réglez la minuterie sur
45 à 60 minutes pour colorer
l’étalement de sang.
7.  Versez doucement de l’eau
propre dans la cuve pour faire
remonter la pellicule irisée.
8.  Éliminez délicatement le reste
de colorant et rincez avec de
l’eau propre.
9.  Retirez délicatement les lames
et laissez-les sécher.
10.  Jetez
la solution de Giemsa à
3 % restante.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
Pour la méthode lente (à 3 %)
1. Estimez le volume de solution de travail Giemsa à 3 % dont
vous aurez besoin pour le nombre de lames à colorer.
Préparez le colorant juste avant de l’utiliser, conformément
au DMP-MON-04 : Préparation d’une solution de
travail Giemsa.
2. Fixez chaque frottis, de préférence avec une pipette de
Pasteur ou en les faisant tremper deux secondes dans un
petit récipient ou un bécher contenant du méthanol. Évitez
tout contact entre la goutte épaisse et le méthanol ou ses
émanations, qui fixeraient rapidement les gouttes épaisses
et entraveraient l’hémolyse de la goutte épaisse.
3. Placez l’étalement de sang sur un râtelier ou un égouttoir.
Laissez les frottis fixés au méthanol sécher complètement
à l’air (durant environ 2 minutes) en plaçant les lames sur
une surface plane. Ne laissez jamais les lames sécher à
la verticale avec le frottis vers le bas, les émanations du
méthanol risqueraient de fixer la goutte épaisse.
4. Mettez les lames dos à dos dans la cuve de coloration,
en veillant à mettre toutes les gouttes épaisses du même
côté de la cuve.
5. Versez délicatement le colorant dans la cuve de coloration.
Ne le versez pas directement sur les gouttes épaisses, ce qui
pourrait les détacher des lames.
6. Réglez la minuterie sur 45-60 minutes (la durée de
coloration devrait être définie à un stade antérieur en
testant le lot de solution mère utilisé), et laissez le colorant
agir sur les lames. Avec l’expérience, vous saurez le temps
exact qui convient pour obtenir une bonne coloration.
Voir DMP-MON 3c : Contrôle de la qualité de la solution
mère de Giemsa.
7. Versez doucement de l’eau tamponnée dans la cuve pour
faire remonter la pellicule irisée. Pour ne pas perturber
les gouttes épaisses, verser l’eau du côté des frottis.
Une manière moins satisfaisante de rincer les lames
consiste à immerger toute la cuve dans une cuvette remplie
d’eau propre, en prenant soin d’éviter la pellicule irisée au
moment d’enlever la cuve de ce récipient.
8. Éliminez délicatement le reste de colorant et rincez avec de
l’eau tamponnée.
9. Enlevez les lames avec soin, une par une, et mettez-les
sur l’égouttoir ou râtelier, la face portant les étalements
vers le bas, pour les faire sécher. Veillez bien à ce que les
gouttes épaisses ne soient pas en contact avec les bords
de l’égouttoir.
10. Jetez la solution de Giemsa à 3 % restante.
4
DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM

6. REMARQUES
Séchage de la goutte épaisse
Les gouttes épaisses doivent être complètement sèches avant d’être colorées. On peut accélérer le
séchage avec de l’air chaud provenant d’un petit sèche-cheveux. Il faut éviter de surchauffer les lames,
faute de quoi la chaleur fixe les étalements de sang qui prennent mal la coloration ensuite.

Utilisation d’eau tamponnée pour le rinçage des lames

La valeur du pH de l’eau utilisée pour le rinçage est importante ; une eau trop acide pourrait décolorer les
étalements. Il est par conséquent recommandé de rincer les lames à l’aide de la même eau tamponnée
que celle utilisée pour la coloration et dont le pH est à 7,2.

Entretien de la verrerie et du matériel de mesure

Les éprouvettes, les pipettes, les cuves de coloration et les béchers doivent être propres et secs avant toute
utilisation. La coloration des étalements de sang avec du matériel sale donne de mauvais résultats.
Tout le matériel utilisé pour la coloration de Giemsa doit être rincé immédiatement après usage dans de
l’eau propre pour enlever le plus de colorant possible. Il faut ensuite le laisser tremper un moment dans
une solution savonneuse avant de le laver. Le lavage du matériel avec un détergent doux suffit, à condition
qu’on le rince soigneusement à l’eau propre avant le séchage. Tout détergent restant sur la verrerie ou
le matériel en plastique peut modifier le pH de l’eau et du colorant, ce qui entraînera des colorations de
mauvaise qualité à la prochaine utilisation du matériel.

Avertissement
Pendant la coloration de Giemsa (solution à 3 % ou 10 %), la surface se couvre d’une pellicule métallique
verte. Évitez que celle-ci ne se dépose sur les étalements de sang, car elle peut gêner leur examen par la
suite.
Une fois préparés, les frottis sanguins devraient être colorés le plus rapidement possible. Si vous conservez
les lames en attente de coloration durant quelques jours en climat chaud et humide, cela provoquera une
fixation spontanée, rendant la goutte épaisse inutilisable dans le cadre d’un examen microscopique.

Méthode pour la coloration individuelle de lames

1. Placez les lames une par une sur le support de coloration, en veillant à ce qu’elles ne se
touchent pas.
2. Versez doucement le colorant sur les lames jusqu’à ce que chaque lame soit recouverte. Il faut
compter environ 3 ml de colorant par lame. évitez de verser le colorant directement sur les
gouttes épaisses.
3. Laissez les étalements en contact avec le colorant pendant 45 à 60 minutes avec une solution de
Giemsa à 3 % et pendant 10 à 15 minutes avec une solution de Giemsa à 10 %. Un contrôle de la
qualité interne du colorant vous permettra de déterminer la durée de coloration optimale.
4. Versez délicatement de l’eau tamponnée sur les lames pour faire remonter la pellicule irisée à la
surface du liquide. L’eau tamponnée à pH 7,2 devrait être versée du côté des frottis pour ne pas
perturber les gouttes épaisses ni les détacher.
5. Enlevez les lames, une par une, et mettez-les sur l’égouttoir ou le râtelier pour les faire sécher,
la face portant les étalements vers le bas, en veillant à ce que les gouttes épaisses ne soient pas en
contact avec les bords de l’égouttoir.

7. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES

• DMP-MON-04 : Préparation d’une solution de travail Giemsa
• DMP-MON-3c : Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée

5
DMP–MON–07A: COLORATION AU GIEMSA DES ÉTALEMENTS DE SANG À LA RECHERCHE DE PLASMODIUM

8. RÉFÉRENCES
Techniques de base pour le diagnostic microscopique du paludisme Partie I : Guide du stagiaire.
Deuxième édition. OMS. 2010.
Storey J. Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. 2012. Non publié.

9. HISTORIQUE DU DOCUMENT
Date Personne responsable
Version Commentaires
(mois/année) (Nom, prénom)
Examiné et finalisé par Gonzales, Glenda
Janvier 2016 1 des experts, édité et mis Fonctionnaire technique,
en page WPRO

6
WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.07a © Organisation mondiale de la Santé 2016. Tous droits réservés.