VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016

PRÉPARATION D’UNE SOLUTION

DE TRAVAIL GIEMSA

DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME

MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS ­– DMP-MON-04

1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION

Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour la préparation d’une solution de travail
Giemsa à partir de la solution mère pour la coloration de routine d’étalements de sang à la recherche du
paludisme.
Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance
de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont
obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de
référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des
établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme.

2. HISTORIQUE
Il est recommandé d’utiliser une solution de travail Giemsa fraîchement préparée à l’aide d’une solution
mère de qualité et diluée avec de l’eau tamponnée à pH 7,2 afin que la coloration des étalements de sang
soit optimale. La solution mère de Giemsa fournie aux programmes nationaux est normalisée afin de
réduire les besoins d’ajustements fréquents aux modes opératoires normalisés relatifs à la coloration.
La coloration avec le Giemsa peut être réalisée à l’aide d’une méthode rapide (solution de travail à 10%)
ou d’une méthode lente (solution de travail à 3%). On utilise la méthode rapide dans les dispensaires et les
laboratoires très fréquentés, où la rapidité du diagnostic est en élément essentiel des soins aux patients.
On emploie la méthode lente pour colorer un plus grand nombre de lames, comme c’est le cas dans les
enquêtes transversales ou épidémiologiques et pour les travaux de recherche sur le terrain.
Certains laboratoires préfèrent colorer les lames une à une, même en cas de lots importants, étant donné
qu’on utilise beaucoup moins de colorant Giemsa. Le volume de la solution de travail Giemsa requis,
en particulier pour la coloration individuelle de lames, devrait être calculé avec soin afin d’éviter de
préparer un volume important qui sera conservé longtemps et en fin de compte probablement gâché.

3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS

Pour une solution de travail Giemsa à 10 % :
• du colorant de Giemsa issu de la solution
mère, transvasé et filtré dans un flacon de
25 ou 50 ml ;
• de l’eau tamponnée à pH 7,2 ;
• un bécher ou un tube à essai propre de 5 à
10 ml ;
• une pipette de pasteur et
• du papier filtre Whatman #1.
Pour une solution de travail Giemsa à 3 % :
• du colorant de Giemsa issu de la solution
mère, transvasé et filtré dans un flacon de
25 ou 50 ml ;
• de l’eau tamponnée à pH 7,2 ;
• une éprouvette graduée propre de 100 à
500 ml ;
• une pipette de pasteur et
• du papier filtre Whatman #1.
DMP–MON–04 : PRÉPARATION D’UNE SOLUTION DE TRAVAIL GIEMSA

4. CONSIGNES DE SÉCURITÉ
• Le méthanol (alcool méthylique) est inflammable et très toxique en cas d’ingestion ou d’inhalation ;
quelle que soit la quantité absorbée, il peut provoquer la cécité, voire la mort. Évitez tout contact et
inhalation. Quand on ne l’utilise pas, il doit être conservé dans une armoire fermée à clé.
• Les précautions universelles doivent être observées – y compris pour ce qui est de l’utilisation
d’équipements de protection individuelle adéquats comme les gants, les lunettes de protection et la
blouse de laboratoire.

5. PROCÉDURE
SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
A. Préparation d’une solution de travail A. Préparation d’une solution de travail
Giemsa de 10 ml à 10 % Giemsa fraîche à 10 % à partir de la
solution mère pour la coloration rapide de
1.  Versez quelques lames. Environ 3 ml de colorant
9 ml d’eau tamponnée dans un sont nécessaires pour chaque lame.
bécher ou un tube.
1. Versez 9 ml d’eau tamponnée prête à
l’emploi à pH 7,2 dans un bécher ou un tube
propre.

2.  2. Filtrez la solution mère de Giemsa
à l’aide d’un papier filtre Whatman #1
et versez-la dans un récipient de 25 à
50 ml.
3.  Ajoutez 1 ml de solution mère.
2. Filtrez la solution mère de Giemsa à l’aide
d’un papier filtre Whatman #1 et versez-la
dans un récipient de 25 à 50 ml.
3. À l’aide d’une pipette propre et sèche,
ajoutez 1 ml de solution mère de Giemsa.
Ne prélevez pas la partie aliquotée du
flacon principal contenant la solution mère,
afin d’éviter de la contaminer.

4. Préparez la solution de travail Giemsa

4.  Utilisez
le colorant dans les
15 minutes qui suivent la préparation et
jetez le reste de colorant inutilisé.
juste avant la coloration du ou des
étalement(s) de sang et utilisez-la dans
un délai maximum de 15 minutes après la
préparation. Jetez tout reste de colorant
inutilisé.

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DMP–MON–04 : PRÉPARATION D’UNE SOLUTION DE TRAVAIL GIEMSA

SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ

B. Préparation d’une solution de travail B. Préparation d’une solution de travail
Giemsa de 100 ml à 3 %. Giemsa fraîche à 3 % à partir de la
solution mère pour la coloration lente d’un
1.  Versez lot de 20 à 100 lames.
97 ml d’eau tamponnée dans un
1. Versez 97 ml d’eau tamponnée prête à
cylindre gradué.
l’emploi à pH 7,2 dans un cylindre gradué
propre.

2.  Filtrez la solution mère de Giemsa 2. Filtrez la solution mère de Giemsa à l’aide
à l’aide d’un papier filtre Whatman #1 d’un papier filtre Whatman #1 et versez-la
et versez-la dans un récipient de 25 à dans un récipient de 25 à 50 ml.
50 ml.

3. À l’aide d’un cylindre gradué ou d’une

pipette, mesurez 3 ml de solution mère de
Giemsa. Ne prélevez pas la partie aliquotée
3.  Ajoutez 3 ml de solution mère.
directement du flacon principal contenant la
solution mère, afin d’éviter de la contaminer.

4.  Utilisez 4. Préparez la solution de travail Giemsa

le colorant dans les
15 minutes suivant la préparation et
jetez le reste de colorant inutilisé.
juste avant la coloration du ou des
étalement(s) de sang et utilisez-la
dans un délai maximum de 15 minutes
après la préparation. Jetez tout reste de
colorant inutilisé.

6. REMARQUES
• Les cylindres gradués, pipettes, récipients et tubes à essai doivent être secs et propres avant d’être
utilisés.
• Ne préparez pas une quantité unique de colorant de Giemsa à utiliser ou réutiliser au cours de
la même journée ou des jours qui suivent. Le colorant de Giemsa absorbe rapidement la vapeur
d’eau présente dans l’air, et lorsqu’on le dilue avec de l’eau distillée, ionisée ou toute autre forme
d’eau, il perd rapidement ses propriétés colorantes, ce qui se traduit, après peu de temps, par une
mauvaise coloration des lames. La pellicule irisée se trouvant à la surface du colorant préparé
adhère facilement à l’étalement de sang, empêchant l’identification de structures.

7. CALCUL DU VOLUME DE SOLUTION MÈRE DE GIEMSA ET D’EAU TAMPONNÉE

NÉCESSAIRE À LA COLORATION INDIVIDUELLE DE LAMES
Chaque étalement de sang nécessite 3 ml de solution de travail de colorant de Giemsa. Par conséquent,
le volume de solution mère de Giemsa requis pour la coloration individuelle de lames peut être calculé à
l’aide la formule suivante :

le volume de solution mère de Giemsa requis par lame =

la concentration de Giemsa requise x 3 ml.

Le volume d’eau tamponnée (pH 7,2) dont vous avez besoin pour la coloration d’une seule lame peut être
calculé comme suit :

le volume d’eau tamponnée par lame = 3 ml – le volume de solution mère requis par lame.

Pour préparer 3 ml de solution de travail Giemsa, ajoutez le volume de solution mère requis par lame en
ajoutant le volume d’eau tamponnée à pH 7,2 calculé par lame.

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DMP–MON–04 : PRÉPARATION D’UNE SOLUTION DE TRAVAIL GIEMSA

Exemple 1 : Coloration de 15 lames avec une solution de Giemsa à 10 %

Le volume de solution mère de Giemsa requis pour la coloration individuelle de 15 lames à l’aide d’une
solution de Giemsa à 10 % peut être calculé à l’aide la formule suivante :
10 x 3 ml x 15 lames = volume de solution mère requise par lame
100
(0,1 x 3 ml) x 15 lames = 4,5 ml
De la même façon, le volume d’eau tamponnée à pH 7,2 requis pour la coloration individuelle de 15
lames à l’aide de la solution Giemsa à 10 % peut se calculer comme suit :
[3 ml – (0,1 x 3 ml)] x 15 lames = volume d’eau tamponnée par lame
[3 ml – (4,5 ml)] x 15 lames = 40,5 ml
Par conséquent, 4,5 ml de solution mère de Giemsa devraient être mélangés à 40,5 ml d’eau
tamponnée pour préparer le volume de solution de travail Giemsa à 10 % requis pour la coloration
individuelle de 15 étalements de sang.

8. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES

DMP-MON-02 : Préparation d’une solution mère de Giemsa
DMP-MON-3a : Préparation d’eau tamponnée à pH 7,2
DMP-MON-3b : Préparation d’eau tamponnée à pH 7,2 à partir de comprimés tampons
DMP-MON-3c : Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée
DMP-MON-7a : Coloration au Giemsa des étalements de sang à la recherche du paludisme

9. RÉFÉRENCES
OMS. Techniques de bases pour le diagnostic microscopique du paludisme – Partie I : Guide du stagiaire.
Deuxième édition. Genève, 2015.
Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria
parasites. Atlanta, Georgia; 2013 (http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/malaria_
staining_benchaid.pdf, accessed 14 December 2015).

10. HISTORIQUE DU DOCUMENT

Date Personne responsable
Version Commentaires
(mois/année) (Nom, prénom)
Examiné et finalisé par Gonzales, Glenda
Janvier 2016 1 des experts, édité et mis Fonctionnaire technique,
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