TP1 : Etude de la cinétique enzymatique avec l’exemple de l’amylase

Une enzyme est une protéine qui accélère une réaction biochimique qui serait trop lente
sans elle. Elle fonctionne dans des conditions de pH et température optimales, qui sont celles du
type de cellules ou milieu où elle agit. Suffixe -ase.

L’amylase est une enzyme produite par des glandes digestives chez les animaux, par les graines en
germination et par certaines bactéries. Son pH optimal est de 7 pour la salive et le pancréas. Il est de
4,5-5,5 pour le blé en germination. Sa température optimale est de 37 °C pour la salive et le
pancréas, mais de 60 °C pour le blé en germination. C’est une enzyme thermostable.
Elle dégrade l’amidon, polymère de glucose en petites molécules de glucose.

Activité 1 : Influence de la concentration en enzyme sur la digestion enzymatique de l’amidon

➢ On veut vérifier que la concentration en enzyme influence la vitesse de disparition de l’amidon

Données : L’étude de la réaction enzymatique peut se faire en suivant la disparition du réactif

(=substrat) ou l’apparition d’un produit ou les deux. Le test à l’eau iodée permet de détecter la
présence d’amidon.
Le test à l’eau iodée Négatif : jaune (absence d’amidon) Positif : bleu- violet (présence d’amidon)

Vous disposez d’une solution d’amidon à 0.5% et d’une solution d’amylase, d’eau distillée, de
pipettes graduées, d’un bain marie à 37°C, de tubes à essai.

➢ Etape 1 (ECE) Proposer une démarche en précisant les résultats attendus.

➢ Etape 2 : Protocole
Nous procéderons par une mesure de l’intensité du violet de l’eau iodée qu’on estimera
proportionnelle à la quantité d’amidon. Cette mesure se fait par un colorimètre (ou
spectrophotomètre,voir photo page suivante) qui mesure l’absorbance d’une solution. L’absorbance
est la capacité d’une solution à absorber la lumière d’une longueur d’onde donnée (c’est-à-dire
d’une couleur donnée)

Mettre l’appareil sous tension

Tourner la molette pour sélectionner la longueur d’onde 590 nm (couleur de l’eau iodée en présence
d’amidon) puis appuyer pour valider
Tourner la molette pour sélectionner ABSORBANCE (encadré en pointillé) puis appuyer pour
valider
590 nm

Ce PC. D : lecteur de CD W lanceur foxy.exe. GENERALISTE

1) positionner les icônes correspondant sur les

axes de abscisses et ordonnés
2) indiquer une durée de 5 min
3) préparer votre tube 1 : avec une petite
seringue, verser dans la cuve 0,5 mL
d’amylase. Placer la cuve dans l’emplacement
prévu pour sur le colorimètre
4) préparer dans une grosse seringue 2,5 mL
d’amidon déjà coloré à l’eau iodée (sans la
verser dans la cuve)
5) lancer l’acquisition sur le logiciel avec le
feu tricolore
6) à t=30 secondes, injecter en une seule fois
et rapidement l’amidon coloré dans la cuve

Attention à ne pas
écraser la ou les
courbe(s)
précédente(s)
Voici la composition des tubes. Les mettre au bain marie à 37°C. Verser l’enzyme en premier
PUIS n’injecter le substrat (l’amidon) qu’après 30 s de mesure.

tubes 1 2 3 4
Amidon à 0.5% 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
coloré à l’eau
iodée (lugol) à
N’AJOUTER qu’à
t=30 secondes !
eau distillée 0 ml 0,25 ml 0,375 ml 0,5 ml
quantité 0,5 ml 0,25 ml 0,125 ml 0
d’amylase (E) (E /2) (E/4) Pas d’enzyme

➢ Etape 3 : Présenter les résultats et les interpréter

Pour la présentation, vous pouvez lisser vos courbes dans l’onglet Affichage – 3) traitement
des données. Onglet sur le côté gauche Lissage. Tracer.
Puis enlever la courbe « brute » dans Affichage -7) Affichage, décocher les courbes en trop.
Modifier la couleur d’une courbe, Clic droit sur la courbe dans le panneau d’affichage,
propriété, apparence, couleur à changer
Ajouter un nom adéquat à l’axe des ordonnées. Ajouter un titre
➢ Etape 4 : Répondre au problème posé

Activité 2 Influence de la concentration en substrat sur la digestion enzymatique de l’amidon

On veut vérifier que la concentration en substrat influence la vitesse de disparition de l’amidon

Même test que dans l’activité 1
Etape1 Proposer une démarche en précisant les résultats attendus.

Etape 2 : Protocole :
Voir celui de l’activité 1
Mettre un repère sur les tubes. Les mettre au bain marie. Verser l’enzyme en premier puis l’amidon
coloré à t=30 s. Donner le contenu des tubes pour faire varier la concentration en substrat
tubes 1 2 3 4
Substrat ; 2,5 ml ml ml ml
amidon à 0.5% à
N’AJOUTER qu’à
t=30 secondes !
eau distillée 0ml ml ml ml
quantité 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
d’amylase

➢ Etape 3 : Présenter les résultats et les interpréter → voir étape 3 de l’activité 1

➢ Etape 4 : Répondre au problème posé
 DM Exploiter les résultats de l’activité 2

1 2 min

rappel: L’absorbance est une grandeur sans unité. Elle est proportionnelle à la quantité d’amidon.

Travail à faire pour présenter différemment les résultats :

➢ Calculer la vitesse initiale de dégradation de l’amidon pour les 5 manipulations où on a
changé la concentration d’amidon mise au départ. Pour cela, tracer la tangente à la courbe
(c’est une droite). Choisir 2 points (points A et B) les plus éloignés possibles sur la droite
tracée. Calculer la pente selon la formule (yB – yA) / (xB – xA). Puis Vinitiale = - pente
➢ Construire le graphe d’évolution de la vitesse initiale de dégradation de l’amidon en
fonction de la quantité d’amidon injecté en début d’expérience en présence d’amylase
➢ Conclure (réponse au pb de l’activité 2)

Exemple de droite de vitesse initiale

B
pente de la vitesse initiale (courbe rose)= (0 – 1,15) / (0,9-0,5) = -2,875 /min. 55s fait 0,9 min. 30s=0,5min