Université Frères Mentouri Constantine

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie et Ecologie Végétale

Protocoles des travaux pratiques de Biologie moléculaire

Licence Biologie et Physiologie Végétale et M1 BPV

Extraction et amplification d’un fragment de l’ADN

génomique d’Arabidopsis thaliana ou la motarde des
champs par réaction de polymérisation en chaine ( PCR)

Enseignants assurant l’atelier :

 Chaib Ghania
 Zoghmar Meriem
 Ingénieurs de labo Biologie Moléculaire (Mme Bouzidi Nadjet)
 Les Doctorants : Atoui Aicha
Labed Hanane

Hamani Hanane
Benmehdi Oussama
Le but du TP

o Extraction et la purification de l’ADN génomique d’Arabidopsis thaliana ou la motarde

des champs)
o L’Extraction de l’ADN a un but d’isoler l'ADN à partir d’un matériel vivant.
o Identification des gènes ciblent

Le principe : L’extraction d’ADN consiste à :

o La lyse des cellules (éclater les cellules)

o Elimination des protéines
o Elimination des autres acides nucléiques ARN (méthode Kit)
o Concentration de l’ADN par précipitation à l’alcool.

Parmi les organismes modèle ; Chez les procaryotes : E. coli , Eucaryotes : Sccharomyceses (levure).
Donc en peut faire une extraction de l’ADN chez les bactéries, animale(Drosophile) et végétale(
Arabidopsis, trèfle, le blé, le chou etc)
Il y a 2 méthodes d’extraction de l’ADN :

1) EXTRACTION D'ADN génomique d'Arabidopsis thaliana

* Méthode dite «rapide »
- Prélever 2/3 plantules et les mettre dans un tube Eppendorf de 1,5 ml
- Broyer à l'aide d'un piston pellet (pour éclater les cellules).
- Ajouter 400 µl de Tampon d'extraction
 (200 mM TrisHCl pH 7.0, tampon pour neutraliser le pH7 de la solution.
Solution à pH stable (tamporiser)
 250 mM NaCl, à forte concentration précipiter l’ADN par contre à faible
concentration pour précipiter tous les macro-éléments « enzymes, hormones,
ARN, protéines sauf l’ADN »)
 25 mM EDTA c’est acide stable pour inhiber les nucléase.
 et 0,5 % SDS) c’est un détergeant qui servira avec Nacl de dégrader les lipides
membranaire.

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- Vortexer 5s (on peut laisser les échantillons à température ambiante le temps de tous les
faire)
- Centrifuger 1 min à 13 000 rpm à 4°C.
- A 300 µl d'Isopropnnol ajouter 300 µl de surnageant (on a recupéré le surnageant parce qu’il coprend
l’ADN) (servira à précipiter l’ADN en fonction de la densité + centrifugation « la molécule, + Isopropanol elle
devient plus dense « )

- Incuber à température ambiante 2 min

- Centrifuger 5 min à 13 000 rpm à 4° C (elle va séparer les molécules selon la densité).

- Ajouter 300 µl l’éthanol à 70 % et mélanger délicatement en inversant le tube pour laver le

culot d’ADN.
-Centrifuger 1 min à 13 000 rpm
- Eliminer délicatement le surnageant
- Inverser le tube et laisser sécher 15 min sur la paillasse (ou Sécher au speed-vac 10 min ou
sur la paillasse 30 min environ sur un papier absorbant
- Reprendre le culot dans 100 µl de TE (Tris – EDTA) puis centrer 1min

- Conserver à 4° C ou à 20°C

2) Electrophorèse sur gel d’agarose :

But : La migration sur un gel d’agarose permet de déterminer la taille des fragments d’ADN après
amplification

Nous utilisons des mini-cuves d'électrophorèse MUPID (Eurogentec), qui permettent

d'avoir un résultat en 30 min.

La migration et le gel se font dans du Tampon Tris Borate EDTA TBE 0,5 × préparé à
partir de TBE 10 × (0,89M Tris, 0,89M Acide Borique, 20 mM EDTA).

1. Peser l'agarose pour préparer 50 ml de gel à 0,8 % dans du TBE 0,5 ×, (0.8g dans 100ml
alors 0.4g dans 50ml de tampon).
2. faire fondre l'agarose, par agitation et chauffage contrôlé (soit sur une plaque
chauffante soit dans un four à micro-ondes (1 à 3 min à intensive élevée). Le gel est
ainsi amené doucement à ébullition :il est nécessaire de bien vérifier que le gel
d’agarose est complètement dissout (liquide claire, absence de particules en

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 suspension). En cas d’évaporation, ajouter de l’eau bi-distillée pour ramener le gel au
volume souhaité.
3. Refroidir le gel d’agarose fondu à une température de 50 à 60 °C

Ajouter 2 gouttes de BET (Bromure d’Ethidium) « il entre dans les liaisons hydrogènes
des base et coloré l’ADN + donc il nous aide pour suivre la migration » mélanger
doucement pour éviter la formation des bulle d’aire (Attention le BET est un agent mutagène).

4. Verser dans un support de gel en évitant la formation des bulle d’air (si on a une on
peut la débarrassé avec un cône et faire plus vite pour éviter le début de la
polymérisation du gel). Insérer un peigne pour former les puits et laisser le reposer le
gel pendant 20 à 30 minutes pour qu’il se solidifie.
5. Lorsque le gel d’agarose est solidifié, retirer le peigne, placer le support contenant le
gel dans l’appareil d’électrophorèse
6. Remplir le réservoir de tampon (identique à celui ayant été utilisé pour la préparation
du gel) afin de couvrir le gel (4 mm au dessus du gel) (Recouvrir le gel de TBE 0,5 X)
7. Préparer dans un nouveau tube : 10 µl d'ADN + 2 µl de tampon de charge (TC 6 X) (il contient
0.02% de bromophénol permet la coloration de dépôt de chaque puits), 0.02% xylène cyanol
et 3% glycérol pour alourdir la molécule d’ADN pour qu’elle tombe sur les puits)« pour
chargé notre molécule d’ADN négativement pH8.8 ». Centré 1 min manuel (le glycérol :
pour alourdir la densité de l’ADN)
8. Déposer 12 µl les échantillons en évitant les bulles d’air,
9. Lancer la migration en réglant le générateur à 100V pendant 20 min. (la migration se faite de la
parti supérieure (près des puits d’échantillon « - ») vers la partie inférieure (l’extrémité du gel
« + ») les molécules d’ADN sont chargées négativement du fait de la présence de phosphate
dans leur nucléotides. Les molécules se séparent alors en fonction de leur poids moléculaires
plus une molécule est lourde moins elle migre.
10. Récupérer le gel délicatement, le mettre sur table UV. (Attention au transport : le gel glisse très
facilement)
11. Prendre une photo au polaroid (attention aux UV !).

ATTENTION LE BET EST UN AGENT MUTAGENE !!!

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 Coloration des gels : Incuber les gels 15 min dans une solution de Bromure
d'Ethidium à 2,5 µg/ml, les rincer 5 min dans de l'H 2 O puis les observer sur la table UV
et prendre une photo.
ATTENTION aux UV !!!

* 2ème Méthode : Wizard genomic DNA Purification kit (d'Arabidopsis thaliana)

- Allumer les bains marie à 65°C et à 37 °C
- Broyer 40 mg maxi de tissu (2/3 plantules) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 600 µl de
Solution de Lyse, vortexer 1-3s broyer à l'aide d'un piston pellet
- Incuber 15 min à 65 °C, mélanger 2 à 3 fois pendant l'incubation
- Ajouter 3 µl de RNase, mélanger en retournant le tube 2 ou 5 fois
- Incuber 15 min à 37 °C, laisser les tubes refroidir sur la paillasse 5 min
- Ajouter 200 µl de Solution de Précipitation des protéines et vortexer vigoureusement 20 s
- Centrifuger 3 min à 13 000 rpm
- Récupérer délicatement 600 µl de surnageant et le transférer dans un tube de 1,5 ml propre
contenant 600 µl d'isopropanol
- Mélanger délicatement en inversant le tube (jusqu'à voir une pelote)
- Centrifuger 1 min à 13 000 rpm
- Eliminer délicatement le surnageant
- Ajouter 600 µl d'Ethanol 70% et mélanger délicatement en inversant le tube pour laver le
culot d'ADN
- Centrifuger 1 min à 13 000 rpm
- Eliminer délicatement le surnageant
- Inverser le tube et laisser sécher 15 min sur la paillasse
- Ajouter 100 µl de solution de Réhydratation de l'ADN ou d'H2O (Incuber 1 h à 65°C).

PCR "Polymerase Chain Reaction"

Le but

La réaction PCR (Polymérase Chain Réaction) permet d'amplifier in vitro une région
spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter
et l’étudier.

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 Le principe

La PCR consiste à :

- Dénaturation : est réalisée environ 95°C, pour une dissociation complète des deux
brins d’ADN
- Hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces
(cette température varie de 50 à 60°C). cette température va déterminer la stabilité des
hybrides une foie que l’appariement amorce /matrice est réalisé. Cette température
varie, elle doit être calculée après chaque PCR.
- Polymérisation est à environ 72°C, température de travail de Taq polymérase. Au
cours de cette étape les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des
extrémités 3’OH libre des amorces hybridées.

Chaque cycle passe par ces trois étapes

3) PCR "Polymerase Chain Reaction"

* Actine 2 d'Arabidopsis thaliana
Oligonucléotides pour amplifier une partie du gène de l'Actine 2 d'Arabidopsis
thaliana (séquence en annexe)
 Act25 : CCATTCTTGCTTCCCTCAG ( T m 5 8 °C)
 Act23 : GACGTAAGTAAAAAC C C AG ( T m 54 °C)
Taille de l'amplifiat : 350 bp
Préparer un mélange dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Le volume du mélange,
dépend du volume de la PCR (25 µl) et du nombre de tubes (ne pas oublier les témoins)
et toujours prévoir 1 tube de plus que nécessaire. Par exemple pour 2 échantillons + 1
Témoin négatif, il faut prévoir un mélange de 4 × 25 = 100 µl.

+ Composition du mélange :

Solutions mères Concentration finale

Tampon 10 × (5x) 1× (1/10) 10 µl
dNTP's 2mM (2,5mM) 0,2mM (0,25 mM) (1/10) 10 µl (5µl)
MgCl2 (40mM) 2 à 8 µl 10 µl (4 µl)
Amorce 5' (10 µM) 0,1 µM (1/100) 1 µl (0,5 µl)
Amorce 3' (10 µM) 0,1 µM (1/100) 1 µl (0,5 µl)

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H2O u.p. qsp vol. final 72 µl
Taq Dna pol (5U/µl) 0,02 U/µl 1 µl

 Mélanger à la pipette, sans faire de bulles

 Répartir 23 µl de mélange/tube de PCR.
 Ajouter 2 µl d'ADN (2 µl d'H2O pour le T-)
+ Programme utilisé :
 94 °C 5min dénaturation
1er cycle
 94°C 30 s dénaturation
 50°C 30 s hybridation 30 cycles
 72 °C 30 s polymerisation
 72°C 7 min finalization dernier cycle

4) Migration

 Préparer des gels d'agarose à 1% comme la veille.

 Préparation des échantillons : Prélever 10 µl de chaque tubes de PCR (ne pas oublier le
Témoin négatif), ajouter 2 µl de tampon de charge.
 Déposer les échantillons.

Les Enseignants d’Atelier BM

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 Annexe 1 : Les micropipettes
Micropipettes :
1- Parties d'une micropipette
a. bouton poussoir
b. Pointe éjecteur
c. Molette de réglage du volume
d. Indicateur de volume numérique
e. Puits
F. Point d'attache pour une pointe jetable
2- Trois tailles de micropipettes
Les micropipettes de ce laboratoire sont disponibles en trois tailles
Différentes, Chacune mesurant une gamme de volumes différente.
Les trois tailles sont :
P20 à couleur rouge
P200 à couleur vert
P1000 à couleur bleu
Ces tailles sont notées sur le dessus du bouton du piston.
Taille Micropipette Gamme de volumes mesurés
P20 : 0.5-20μl
P200 : 20-200μl
P1000 : 100-1000μl
Remarque : Il ya une autre micropipette au volume 2 μl pour l’ajout des Enzymes c’est P 2 à
couleur Jaune

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Annexe 2 : Utilisation des micropipettes

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Attention :

 Ne jamais tourner la molette au déla de la quantité maximale supportée par la pipette.

 Ne pas descendre en dessous de 0( Zéro) avec le réglage.

Annexe III : Plus des conseils pour l’utilisation des micropipettes

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Annexe IV : Matériel à utiliser

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Annexe V : Protocole d’atelier
A- Extraction D’ADN :

B- Electrophorèse et PCR

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