TP Adn Realise en Distanciel Sur Ladn

L1 SVT
Travaux pratiques de Biomolécules B
TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

ANALYSE D’UNE PROPIETE PHYSICOCHIMIQUE:
L’ABSORTION DANS L’UV
1. Introduction:
Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Ils jouent un rôle important
dans le support et le transfert de l’information génétique. Ce sont des macromolécules
pouvant atteindre une taille très élevée, ex : l’ADN de la bactérie Escherichia coli
a un PM = 2x109 Daltons et dépasserait le millimètre s’il n’était pas compacté, alors
que la cellule qui le contient n’a que 1 à 2 µm de diamètre. Excepté dans les globules
rouges des mammifères, qui sont dépourvus de noyau, toutes les cellules d’un être
vivant contiennent de l’ADN.
1. Introduction:
1. Introduction:
Dans les manipulations qui suivent nous proposons :
1/ d’extraire l’ADN à partir d’un tissu biologique,
2/ d’étudier une des propriétés physicochimiques : l’absorption dans l’ultra-violet,
3/ d’utiliser ces propriétés physicochimiques pour quantifier l’ADN contenu dans

l’échantillon biologique,
4/ de manipuler des données scientifiques :

(calculs de dilutions et de concentrations, travail sur les unités, loi de
Beer-Lambert...)
2. Mode opératoire:
Attention dans le protocole il ne faut

pas confondre :
• TE 10X et TAE 10X
• Ethanol absolu et ethanol 70%
2.1 Préparation de l’ADN

a) Homogénéisation du tissu
- A partir de la solution stock (TE 10X) concentrée fournie, préparer 50 mL

de tampon TE 1X dans un tube Falcon de 50 mL. Réservez.
Quelle est le volume de TE 10X et d’eau pour préparer la

solution de TE 1X ? 5 mL de TE 10X et 45 mL d’eau
Cm x Vm = Cf x Vf
10 x Vm = 1 x 50
Vm = (1 x 50) / 10
Vm = 5 mL
Facteur de dilution = Vf / Vm = Cf / Cm
Nous avons dilué 10 fois


- Peser le morceau de banane fourni et noter la masse (normalement entre 10-12g).
Il faut bien penser à faire la tare

avant de mettre la banane :
Appuyer sur le
bouton TARE
0g
15

- Ecraser la banane dans le mortier en porcelaine avec une spatule/cuillère

jusqu’à obtenir une purée homogène.

- Ajouter 15 ml du tampon TE 1X dans le mortier et homogénéiser.

- Transvaser l’homogénat de banane dans un tube de 50 mL et centrifuger

5 minutes à 2000 tours par minute (rpm).
ATTENTION! Il faut vérifier le volume des tubes et équilibrer les masses dans la
centrifugeuse

- Transvaser l’homogénat de banane dans un tube de 50 mL et centrifuger

5 minutes à 2000 tours par minute (rpm).

b) Lyse des cellules
- Filtrer le surnageant obtenu sur un papier filtre à l’aide d’un entonnoir dans un tube
Falcon de 50 mL. Recueillir environ 10-15 mL (V1). Compléter si besoin avec de TE 1X.
+ +
On plie un carré de papier Whatman comme si c’était un filtre à café, on le positionne

dans l’entonnoir, et ensuite on l’introduit dans le tube de 50 mL

- Ajouter du SDS (10%) sur le filtrat pour obtenir une concentration finale de 1% et
agiter au vortex 1 min.

- Ajouter ensuite un volume de NaCl 5M égal à 1/2 V1.


- Agiter fortement au vortex pendant 2 min.

c) récupération de l’ADN
- Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 3000 tours par minute (rpm).


- Récupérer le surnageant dans un tube de 50 mL propre avec une pipette Pasteur

et une petite poire, noter le volume (V2).
Surnageant + +
Culot
Ne pas aller trop vite pour avoir

2. Mode opératoire: une jolie méduse d’ADN ! Ne
pas tout verser d’un coup.
- Ajouter lentement, le long des parois du tube, 2 volumes V2 d’éthanol froid

(congélateur, - 20°C).
EtOH +
- 20°C

- Après 1 ou 2 min une « méduse » d’ADN se forme à l’interface tampon/éthanol.

Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer :
1) Un tube à essai contenant 3 à 4 mL d’éthanol 70%.


2) Préparer 10 mL de tampon TAE 1X (ATTENTION !!!) dans l’éprouvette graduée

à partir du stock TAE 10X, et transvaser dans un tube Falcon de 15 mL.
TAE
10X
10 mL de TAE 1X = 1 mL de TAE 10X + 9 mL d’H2O


3) Mettre 3 mL du TAE 1X dans un autre tube Falcon de 15 mL.
3 mL de TAE 1X

- Récupérer l’ADN en l’enroulant autour d’une pipette Pasteur propre et le placer dans
le tube à essai contenant les 3 à 4 mL d’éthanol à 70%.

- Rincer l’ADN dans de l’éthanol 70% pendant 30 sec.


- Placer la pelote d’ADN dans le tube Falcon de 15 mL contenant les 3 ml de TAE 1X

et vortexer pendant 1 min → Solubilisation de la pelote d’ADN
2.2 Dosage de l’absorbance dans l’UV de l’ADN
- Diluer 600 µL de solution d’ADN que vous venez de préparer dans 2,4 mL de
TE 1X (solution utilisée pour écraser la banane) dans le tube à essai restant.
Vortexer.
600 µl d’ADN
+ 2,4 mL de TE 1 X
- Mesurer l’absorbance de cette solution dans une cuve adaptée à 260 nm et à 280 nm
(penser faire le 0 avec de l’eau distillé, et à faire le blanc de l’essai avec le tampon
TE 1X). Utiliser tout le temps la même cuve pour tous les dosages.
- Mesurer l’absorbance de cette solution dans une cuve adaptée à 260 nm et à 280 nm
(penser faire le 0 avec de l’eau distillé, et à faire le blanc de l’essai avec le tampon
TE 1X). Utiliser tout le temps la même cuve pour tous les dosages.
+ H2O Absorbance = 0
Faire le blanc
+ TE 1X Mesure de l’absorbance du tampon

Faire le blanc
Solution d’ADN Mesure de l’absorbance ADN + tampon

+
dans TE 1X
Faire le blanc
2. Mode opératoire (résumé partie 1)
2. Mode opératoire (résumé partie 2)

3. Contre - rendu: But/ principes/ résultats et discussion/conclusion
3.1 But du TP: c’est quoi l’objectif de cette première partie?

Qu’est-ce qu’on veut déterminer?
L’objectif du TP est réaliser l’extraction de l’ADN de banane et analyser une de

ses propriétés physico-chimiques.
3.1 But du TP: c’est quoi l’objectif de cette première partie?

Qu’est-ce qu’on veut déterminer?
L’objectif du TP est réaliser l’extraction de l’ADN de banane et analyser une de

ses propriétés physico-chimiques.
3.2 Principes des manipulations de TP: quels sont les techniques utilisés?
Expliquer le fondement scientifique, pas la recette de cuisine!
- Extraction de l’ADN (SDS, NaCl, EtOH)
- Absorption de UV de l’ADN et Loi de Beer-Lambert

- Absorption de UV de l’ADN
Un grand nombre de molécules d'intérêt biologique absorbent en lumière ultraviolette

(200 à 320 nm) ou visible (320 à 800 nm). D'autres molécules n'absorbent pas mais
peuvent donner avec un réactif approprié un composé possédant un spectre
d'absorbance, permettant ainsi un dosage spectrophotométrique.
- Loi de Beer-Lambert
a) Quelle est le rôle du SDS et du NaCl dans cette expérience ?
Le SDS est un détergent et va provoquer la rupture des membranes plasmiques

et nucléaires donc il va faciliter la libération de l’ADN. Le Na+ du NaCl va à venir
à entourer les molécules d’ADN, chargés de manière négative. L’ADN en présence
des ions Na+ va se détacher des histones et les faire précipiter donc faciliter
l’extraction d’ADN dans le surnageant après centri.
b) Notre ADN est-il fragmenté après les procédures réalisées dans ce TP ?

Pourquoi ?
Non, les méthodes physiques utilisés (vortex, agitations) ne sont pas suffisamment
fortes pour casser notre ADN, on devrait utiliser la sonication ou l’action d’enzymes de
restrictions par exemple comme EcoRI ou HindIII qui reconnaissent des séquences
assez communes dans l’ADN.
c) Quel était la masse de votre morceau de banane ?

On prendra comme exemple 10 g
d) Quel était le volume du filtrat (V1) ?

On prendra comme exemple 10 mL
c) Quel était la masse de votre morceau de banane ?

On prendra comme exemple 10 g
d) Quel était le volume du filtrat (V1) ?

e) Quel volume de SDS 10% doit-on ajouter pour avoir une concentration finale
de 1%?
Vi = le volume de SDS 10% à ajouter

Vf= 10 mL + Vi
CiVi= CfVf ; 10%Vi= 1% (Vi+10) ;
10%Vi= Vi +10 ;
9Vi = 10 ;
Vi= 10/9 ; Vi =1,11 mL de SDS 10%

f) Quel était le volume de NaCl 5M ajouté ? Quelle sera la concentration de NaCl

finale dans le tube ?
Volume de NaCl = 1/2 V1 = 5 mL
Vfinal= (10 de filtrat+ 1,11 mL de SDS 10% + 5 mL de NaCl 5 M) = 16,11 mL
CiVi= CfVf ;
5M x 5 mL = Cf x 16,11 ml ;
Cf= 1,55 M
g) Quel est le volume du surnageant d’ADN (V2) ?


h) Quelle dilution a-t-on fait pour mesurer les A à 260 et 280 nm ?

Dilution par 5 car 3 / 0,6 = 5 (600 µL dans 3 mL)


i) Notez les A :
A tampon 260= 0,006 A sol ADN 260= 0,159
A tampon 280= 0,004 A sol ADN 280= 0,092
j) Calculer le rapport A260/A280 :

L’absorbance corrigé de l’ADN à 260 ou 280 nm sera :
l’absorbance de la solution d’ADN – l’absorbance du tampon
A260/A280 : (0,159-0,006) / (0,092-0,004) = 0,153 – 0,088 = 1,74
Pour des solutions d’ADN pures, ce rapport est compris entre 1,8 et 2. Si ce rapport
est inférieur à 1,8 l’extrait d’ADN est contaminé avec des protéines. Si en revanche le
rapport est supérieur à 2, l’extrait d’ADN est contaminé avec de l’ARN.


i) Notez les A :
A tampon 260= 0,006 A sol ADN 260= 0,159
A tampon 280= 0,004 A sol ADN 280= 0,092
j) Calculer le rapport A260/A280 :

L’absorbance corrigé de l’ADN à 260 ou 280 nm sera :
l’absorbance de la solution d’ADN – l’absorbance du tampon
A260/A280 : (0,159-0,006) / (0,092-0,004) = 0,153 – 0,088 = 1,74
k) Donner vos conclusions sur le degré de pureté de votre extrait d’ADN

Notre ADN est plutôt de bonne qualité et bien extrait. Il y a une légère contamination
de protéines, très probablement des histones.
l) Calculer la concentration (en µg/ml) de la solution d’ADN que vous avez

purifiée, en utilisant la loi de Beer-Lambert.
A 260 nm, le coefficient d’extinction spécifique (E) de l’ADN double brin est
d’environ 0,02 (µg/ml)-1cm-1
A260= c x E x l ;
Attention! l’absorbance à 260 nm est l’absorbance corrigé de l’ADN!
0,153 = c x 0,02 x 1 ;
c = 7,65 µg/mL
m) Quelle était la quantité d’ADN présente dans 1g de banane ?

Détailler le calcul.
A260= c x E x l ; 0,153 = c x 0,02 x 1 ; c = 7,65 µg/mL
Dans la dilution : 7,65 µg/mL et il y a 3 mL de TE 1X donc 7,65x 3 = 22,95 µg
Dans l’ADN : 22,95 µg - 0,6 mL (ADN)
X- 3 mL ADN final (en 3 ml de TAE 1X)
X= 114,75 µg
114,75 µg – 10 mL de filtrat – 10 g de banane
11,475 µg/1g de banane

Conclusion (résumé TP, résultats principaux, schéma, critique constructive,

autres techniques qui peuvent substituer le technique utilisé…)
Discuter la quantité d’ADN obtenu…
Discuter la concentration d’ADN au départ et dans la dilution…
Fig.1 Spectre d’absorption de l’ADN (SAB=albumine sérique bovine)
4. Compétences développées :
Afin de préparer le remplissage de votre portefeuille

d’expériences et de compétences (https://www.pec-univ.fr/accueil-1.kjsp), choisissez
les 2 compétences scientifiques et les 2 compétences transversales que vous pensez
avoir le plus développées durant la séance :

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TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

Dans les manipulations qui suivent nous proposons :

1/ d’extraire l’ADN à partir d’un tissu biologique,

2/ d’étudier une des propriétés physicochimiques : l’absorption dans l’ultra-violet,

3/ d’utiliser ces propriétés physicochimiques pour quantifier l’ADN contenu dans

4/ de manipuler des données scientifiques :

Attention dans le protocole il ne faut

• TE 10X et TAE 10X

• Ethanol absolu et ethanol 70%

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

2.1 Préparation de l’ADN

- A partir de la solution stock (TE 10X) concentrée fournie, préparer 50 mL

Quelle est le volume de TE 10X et d’eau pour préparer la

Nous avons dilué 10 fois

2.1 Préparation de l’ADN

- Peser le morceau de banane fourni et noter la masse (normalement entre 10-12g).

Il faut bien penser à faire la tare

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

2.1 Préparation de l’ADN

- Ecraser la banane dans le mortier en porcelaine avec une spatule/cuillère

2.1 Préparation de l’ADN

- Ajouter 15 ml du tampon TE 1X dans le mortier et homogénéiser.

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

2.1 Préparation de l’ADN

- Transvaser l’homogénat de banane dans un tube de 50 mL et centrifuger

2.1 Préparation de l’ADN

- Transvaser l’homogénat de banane dans un tube de 50 mL et centrifuger

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2.1 Préparation de l’ADN

On plie un carré de papier Whatman comme si c’était un filtre à café, on le positionne

2.1 Préparation de l’ADN

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

2.1 Préparation de l’ADN

- Ajouter ensuite un volume de NaCl 5M égal à 1/2 V1.

2.1 Préparation de l’ADN

- Agiter fortement au vortex pendant 2 min.

TP ADN: EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

2.1 Préparation de l’ADN

- Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 3000 tours par minute (rpm).

2.1 Préparation de l’ADN

- Récupérer le surnageant dans un tube de 50 mL propre avec une pipette Pasteur

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Ne pas aller trop vite pour avoir

- Ajouter lentement, le long des parois du tube, 2 volumes V2 d’éthanol froid

2.1 Préparation de l’ADN

- Après 1 ou 2 min une « méduse » d’ADN se forme à l’interface tampon/éthanol.

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2.1 Préparation de l’ADN

Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer :

1) Un tube à essai contenant 3 à 4 mL d’éthanol 70%.

2.1 Préparation de l’ADN

Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer :

2) Préparer 10 mL de tampon TAE 1X (ATTENTION !!!) dans l’éprouvette graduée

10 mL de TAE 1X = 1 mL de TAE 10X + 9 mL d’H2O

2.1 Préparation de l’ADN

Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer :

3) Mettre 3 mL du TAE 1X dans un autre tube Falcon de 15 mL.

2.1 Préparation de l’ADN

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