Travaux Pratiques ELISA

Expérience pour rechercher

une infection au VIH

Démonstration de la présence
d’anticorps anti-VIH dans le sang
 Préparations
par l’enseignant
1. Préparation des solutions tampons
• Tampon PBS (100 ml)
90 ml H O + 10 ml PBS (10x)
2 dist.

Le tampon PBS est nécessaire à la solubilisation

des antigènes et des anticorps hydrophiles.
• Tampon de lavage (900 ml)
805 ml H O + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20
2 dist.

Le tampon de lavage est nécessaire pour diluer la

solution d'anticorps et pour laver les plaques de
microtitrage.
Le Tween 20 contient de la SAB pour bloquer
la surface plastique libre.
 2. Réhydratation

!
• Ouvrir les flacons d‘antigène et
d‘anticorps
• Ajouter 0,5 mL de tampon PBS dans
le flacon d‘antigène et dans les flacons
des anticorps primaire et secondaire
• Fermer les flacons et agiter pendant
environ 2 minutes (solutions mères)

Toutes ces solutions mères sont concentrées 50 fois !

Elles seront diluées juste avant la manipulation
 3. Etiquetage

Etiqueter trois flacons en

polyéthylene avec:

- antigène

- anticorps primaire

- anticorps secondaire
Antigène
Ils accueilleront les solutions diluées
juste avant la manipulation
Préparations
par les élèves

8 équipes
 Vue d‘ensemble des tubes
Couleur Etiquette Contenu Quantité
du tube

vert “AG“ antigène 800 µl

orange “sAB“ Anticorps secondaire 800 µl

marron “SUB“ substrat 800 µl

violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl

bleu “WB“ Tampon de lavage 120 µl

jaune -- -- Encore vide!

1. Preparation des échantillons P1 – P8

- Légender les 8 tubes jaunes avec le numéro de votre

groupe

- Introduire 60 µL d’anticorps primaire (pAB, résultat

!
positif du test)
ou
60 µL de tampon de lavage (WB, résultat négatif du
test) dans chacun des 8 tubes jaunes! Notez votre
démarche
(P1 – P8 sont les échantillons de sérum)

- Distribuer 1 tube à chacune des 8 équipes

 Vue d‘ensemble complète des
tubes
Couleur Etiquette Contenu Quantité
du tube

vert “AG“ antigène 800 µl

orange “sAB“ Anticorps secondaire 800 µl

marron “SUB“ substrat 800 µl

violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl

bleu “WB“ Tampon de lavage 120 µl

jaune “P1 – P8” Sérum sanguin, éch. 1 à 8 60 µl chacun

2. Réalisation du test
 2.1 Fixation de l’antigène sur la
microplaque de titration

- Légender la microplaque selon l’image ci-dessous

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

- Introduire 50 µl de solution d’antigène (AG, tube vert)

dans chacun des 12 puits
- Incuber pendant 5 minutes
 Détection des anticorps
Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

 2.2 Lavage des microplaques de
titration
• Tapotez les microplaques sur un papier absorbant
• Introduire 250 µl de tampon de lavage dans chaque puits

Attention!
Pendant le pipetage, ne pas renverser
de solution de lavage dans les autres
puits!
• Tapotez les microplaques sur un papier absorbant
 Détection des anticorps
Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

 2.3 Préparation des contrôles et des
échantillons

pAb
• contrôle positif: introduire 50 µL d’anticorps
primaire (pAB, tube violet) dans les 2 puits
étiquetés “ + ”

• contrôle négatif: introduire 50 µL de tampon

WB
de lavage (WB, tube bleu) dans les 2 puits
étiquetés “ - ”

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
 2.3 Préparation des contrôles et des
échantillons
• échantillons 1 – 8: introduire 50 µL “d’échantillons de
sérums à tester” P1 – P8 (tubes jaunes) dans les 8
puits etiquetés correspondant

Utiliser un nouveau cône de pipette pour chaque puit !

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

• Incuber 5 minutes
 Détection des anticorps
Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

• Les anticorps primaires

éventuellement présents se fixent sur
les antigènes
2.4 Lavage des microplaques
(voir 2.2 )

vider + 250 µl WB vider

 2.5 Ajout des anticorps
secondaires
• Introduire 50 µL d’anticorps secondaire (sAB,
tube orange) dans chacun des 12 puits

• Incuber 5 minutes
 Détection des anticorps
Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

• Les anticorps primaires

éventuellement présents se fixent sur
les antigènes
• Les anticorps secondaires (portant
l‘enzyme) se fixent aux anticorps
primaires éventuellement présents
2.6 Lavage des microplaques
deux fois
(voir 2.2 )

vider + 250 µl WB vider

 2.7 Ajout du substrat

• Introduire 50 µL de substrat (SUB, tube marron)

dans chacun des 12 puits

• Incuber 5 minutes
 Détection des anticorps
Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

• Les anticorps primaires

éventuellement présents se fixent sur
les antigènes

• Les anticorps secondaires (portant

l‘enzyme) se fixent aux anticorps
primaires éventuellement présents

• La preuve de l‘infection est faite par la

coloration du puit
 3. Résultats
Les échantillons positifs sont colorés en bleu, les
échantillons négatifs restent incolores (Valider les
contrôles).
Vérifiez vos résultats (P1 – P8) dans l’équipe!

exemple:

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8