Filière SVI

Module d’Immunologie (M30)

SEMESTRE 5

TRAVAUX PRATIQUES D’IMMUNOLOGIE

Année universitaire : 2023-2024

 I- Précipitation en milieu liquide

La précipitation des complexes moléculaires résultant de la liaison Ag-Ac est due

à la formation d'un réseau tridimensionnel d'antigènes réunis par des anticorps. En
fonction de la quantité d’Ac et d’antigène , on peut distinguer trois zones
caractéristiques de la précipitation des Ag par les Ac :
* la zone d'excès d'anticorps où un défaut d'Ag empêche la précipitation de toutes les
molécules d'Ac.
* la zone d'excès d'Ag où l'anticorps n'est pas en quantité suffisante pour précipiter
toutes les molécules d'Ag.
* la zone d'équivalence où les Ac et les Ag sont dans un rapport optimal de
concentration, permettant la précipitation de toutes les molécules d'Ac avec l'Ag
(maximum de précipitation).

Cette technique consiste à mettre dans une série de tubes une quantité constante
d'anticorps, puis à rajouter l'antigène en concentration croissante dans chaque tube,
sous un même volume. Un précipité apparaît : peu épais dans les premiers tubes, il
s'accroît progressivement pour diminuer ensuite. On peut recueillir les précipités après
centrifugation et doser les protéines.

Cette technique a permis pour la première fois de quantifier une réaction

immunitaire. Elle présente un intérêt particulier pour expliquer l'apparition et la
disparition d'un précipité en fonction des concentrations relatives d'anticorps et
d'antigènes.
 MANIPULATION N° 1

IMMUNOPRECIPITATION EN MILIEU LIQUIDE

DOSAGE DU PRÉCIPITÉ ANTIGENE-ANTICORPS

A PARTIR D'ANTIGENES SOLUBLES

I- MATERIEL ET METHODES
A- Matériels:
- Tubes à essai, tubes eppendorfs, pipettes, bain-marie à 37°C.
- SAB (sérum albumine bovine) en solution dans le tampon phosphate (PBS) à la
concentration de 500 µg/ml.
- Antisérum anti-SAB.
- PBS et soude 0,1N.

B- Méthodes:
- A partir de la solution de SAB à 500 µg/ml, préparer des solutions de SAB aux
concentrations suivantes:
31,25 – 62,5 – 125 – 250 µg/ml.
Les dilutions doivent être effectuées dans du PBS.
- Faire réagir 50 l d'anti-sérum avec 250 l de SAB de chacune des solutions.
Cette réaction se fera dans des tubes eppendorfs.

- Incuber 60-90 minutes à 37°C et ensuite 10 minutes à 4°C.

- Faire un tube témoin.
- Centrifuger à 15.000 g pendant 2 minutes.
- Aspirer le surnageant à l'aide d'une pipette pasteur reliée à une trompe à vide.
- Récupérer le culot dans 1 ml de PBS froid, agiter puis centrifuger à nouveau comme
avant.
- Après aspiration du surnageant, reprendre le culot dans 1 ml de NaOH 0,1N, puis
Agiter.
- Lire la densité optique au spectrophotomètre à 280 nm.
 MANIPULATION N° 2

IMMUNOELECTROPHORESE EN FUSEE

II- Immunoéléctrophorèse en Fusée

Le principe consiste à doser des Ag à concentration croissante en présence d’Ac
monospécifique intégré dans le gel sous l’action d’un champs électrique : c’est une méthode
quantitative. L’Ac incorporé dans le gel d’agarose est immobile et l’Ag est chargé
négativement (dans le tampon pH 8,7) et migre à l’encontre de l’Ac dans un champs
électrique. L’arc de précipitation résultant a la forme d’une fusée dont la hauteur est
proportionnelle à la concentration de l’Ag.

Objectif:
Dosage de l'albumine bovine (SAB) en solution en utilisant des anticorps spécifiques.

Matériels :
- 1 Plaque de verre (10 x 10 cm)
- 1 cuve d'électrophorèse et un générateur
- 1 solution d'agarose 1% préparée dans le tampon Tris-Glycine (tris 37,5 mM, glycine 0,1M),
pH 8,7.
- 1 solution mère de SAB à 6 mg/ml
- 1 anti-sérum anti-SAB
- Solutions de SAB X et Y de concentrations inconnues.
- Tampon Tris-Glycine (tris 37,5 mM, glycine 0,1M) pH 8,7

Méthodes :
Il vous sera demandé d'établir un protocole expérimental pour déterminer la
concentration d'une solution de SAB à partir d'une courbe étalon.
 . Gamme étalon de l'antigène SAB

A partir de la solution mère de 500 µg/ml, réalisez 4 essais aux concentrations

suivantes: 31,25 – 62,5 – 125 et 250 μg/ml.

. Préparation des plaques

14 ml d'agarose 1% dissous dans le tampon Tris-Glycine, pH 8,7. Ces 14 ml sont

coulés sur des plaques de verre. Le même tampon est déposé dans les bacs à électrophorèse.
Le pH 8,7 correspond au pH isoélectrique des immunoglobulines.

. Electrophorèse (migration)

Les antigènes sont déposés dans des puits creusés dans l'agarose coulée sur la plaque
de verre. Une fenêtre est découpée dans le gel (voir schéma de l'enseignant). L'agarose
dissoute est mélangée à une quantité déterminée de l'anticorps (300μl d'anticorps dans 6ml
d'agarose) dirigé contre la SAB, puis coulée à l'intérieur de la fenêtre. On dépose 10 μl/puits
de chaque dilution de SAB et 10 μl des solutions inconnues X et Y de SAB dans les derniers
puits. La plaque est ensuite soumise à une tension de 60 volt pendant 18 à 22 heures. Les
antigènes précipitent sous la forme d'un pic dont la hauteur est proportionnelle à la quantité
d'antigène.

II-Compte rendu:

Manipulation N1 :
1°) Donnez le principe de l’immunoprécipitation en milieu liquide. Bien indiquer
les différentes étapes et les paramètres utilisés.
2°) Dans un tableau, indiquer les quantités respectives de la solution mère de SAB
ainsi que les volumes de cette solution et du PBS conduisant aux dilutions obtenues.
3°) Représenter vos résultats d'immunoprécipitation sous forme d'un tableau
(DO à 280 nm en f (quantité d'Ag) et tracer la courbe de précipitation sur papier
millimétré. Porter toutes les indications nécessaires sur la courbe et faire un
commentaire très bref.
4°) Déterminer le titre d'anticorps (concentration de l'anticorps dans l'antisérum,
exprimée en mg/ml).
5°) Déterminer le rapport de concentration molaire Ac/Ag dans la zone
d’équivalence. Interpréter ce rapport.

Données:
- une solution d'IgG pure de lapin à 0,689 mg/ml a une DO (à 280 nm) égale à 1
- une solution de BSA à 1,49 mg/ml a une DO (à 280 nm) = 1.
PM SAB: = 68.000
PM IgG = 150.000
 Manipulation N2 :

1. Présenter de manière synthétique le principe et l’intérêt de la technique

Immunoéléctrophorèse en Fusée.

2. Présenter vos résultats sous forme de courbe (hauteur de la fusée en fonction de la

concentration en antigène).

3. Calculer la concentration des solutions X en g/ml

4. Comparez vos résultats à ceux de vos camarades (sous forme d'un tableau) et commenter
les résultats obtenus.