2023-2024

TP IMMUNOLOGIE
S5
Compte rendu corrigé

I- Manipulation N°1 : Immunoprécipitation en milieu liquide

1- Principe
La technique consiste à répartir dans une série de tubes une quantité constante
d’anticorps d’un sérum immun et des dilutions croissantes d'une solution
antigénique. Après incubation, un précipité apparaît après centrifugation, Le
précipité obtenu est récupéré. Les protéines sont ensuite dosées.

- Etapes
Incubation (37°C), Centrifugation, Refroidissement (+4°C), PBS froid,
Centrifugation, NaOH, Lecture de la DO 280 nm.

- Paramètres

. Paramètres physiques : Température, Centrifugation, Longueur d’onde

280 nm.
. Paramètres chimiques : PBS, NaOH.
 2-Tableau des dilutions
Les solutions de SAB (Albumine du sérum bovin): solution mère à 500 µg/ml ;
il faut préparer 4 solutions à 31.25, 62.5 , 125 et 250µg/ml.

SAB (µg/ml) Vp (ml) V PBS (ml) Vf (ml) Cf (µg/ml)

500 1 1 2 250
250 1 1 2 125
125 1 1 2 62.5
62.5 1 1 2 31.25

3-
a -Tableau (DO à 280 nm en f (quantité d’Ag)

31.25 µg/ml 62.5 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml

Quantité (µg) 7.81 15.63 31.25 62.5
DO à 280 nm 0.164 0.520 0.174 0.143

Exemple de calcul : Pour [Ag] = 31.25 µg/ml

31.25 µg 1 ml
X 250 µl=0.250 ml
X = 7.81µg
b- Courbe DO en f (quantité d’Ag)
DO 280 nm
DOmax = 0.520

15.63 µg/essai Quantité d’Ag (µg)

 c- Commentaire
En fonction de la quantité d’Ac et d’antigène on peut distinguer trois
zones caractéristiques de la précipitation des Ag par les Ac :
* la zone d'excès d'anticorps où un défaut d'Ag empêche la précipitation de
toutes les molécules d'Ac.
* la zone d'excès d'Ag où l'anticorps n'est pas en quantité suffisante pour
précipiter toutes les molécules d'Ag.
* la zone d'équivalence où les Ac et les Ag sont dans un rapport optimal de
concentration, permettant la précipitation de toutes les molécules d'Ac avec
l'Ag (maximum de précipitation).

4- Détermination du titre d’anticorps en mg/ml

Dans la zone d’équivalence : DOmax= DOAg-Ac= DOAg+DOAc
-Calcul de la DOAg :
1 UDO 1.49 mg/ml
DOAg 15.63 µg/essai = 15.63 µg/ 250µl= 0.0625 µg/ml

Donc : DOAg = 0.0419

-Calcul de la DOAc:
On sait que DOmax= DOAg-Ac= DOAg+DOAc
DOAc= DOmax-DOAg
DOAc= 0,520-0.0419
Donc :DOAc= 0,478

-Calcul de la [Ac] en mg/ml

On a 1 UDO 0.689 mg/ml
0,478 [Ac] mg/ml
Donc :[Ac] = 0.329 mg/ml
-Calcul de la [Ac] en mol/l
On a [Ac] = 0.329 mg/ml
Et PMAc= 150 000 g/mol
Donc [Ac] = 0.329 / 150000=2.19x10-6 mol/l

4- Détermination du rapport de la concentration molaire :

[Ac]/ [Ag]
On a :
[Ag]= 0.0625 µg/ml et PMAg=68 000 g/mol
Donc :[Ag]= 0.0625/68000= 9.19x10-7mol/l
Or :[Ac]= 2.19x10-6mol/l

Finalement : [Ac]/ [Ag]= 2.19x10-6/9.19x10-7mol/l

[Ac]/ [Ag]≈2
Il s’agit d’un anticorps bivalent
II- Manipulation N°2 : Immunoelectrophorese en fusée

1- Principe
Le principe consiste à doser des Ag à concentration croissante en
présence d’Ac monospécifique intégré dans le gel sous l’action d’un
champs électrique : c’est une méthode quantitative .L’Ac incorporé
dans le gel d’agarose est immobile et l’Ag est chargé négativement
(dans le tampon pH 8,7) et migre à l’encontre de l’Ac dans un champs
électrique. L’arc de précipitation résultant a la forme d’une fusée dont
la hauteur est proportionnelle à la concentration de l’Ag.
Intérêt: Dosage de l'albumine (SAB) dans une solution donnée en
utilisant des anticorps spécifiques.

2- Résultats
+

Gel d’agarose
Migration 1% dans un
à 60V pd tampon Tris-
20 H
Glycine pH 8,7 ,
le pH tampon est
Gel + choisi de telle
Ac
sorte que les Ag
anti
soient chargés (-)
SAB
- et les Ac
X
immobiles ( pHt
SAB à concentration croissante 31.25 ; 62.5 ; 125 ; et
=pHi des IgG )
250 µg/ml (20 µl/ puit) + concentration inconnue X
 Hauteur de la
fusée (cm)

X SAB µg/ml

3- Calcul de la concentration de X en µg/ml

Pour déterminer la concentration de BSA dans une solution
inconnue, il est nécessaire de construire une courbe d’étalonnage à
partir des résultats obtenus de la gamme de dilutions de la solution
mère de BSA. Les données sont ensuite traduites graphiquement. La
courbe étalon, représentant la hauteur (en cm) des différents pics en
fonction de la concentration de BSA est alors tracée. Pour la gamme
de dilutions utilisées, la relation entre la hauteur (h) et la concentration
de BSA est linéaire comme le montre la figure ci-dessous
correspondant aux résultats obtenus pour la gamme de concentration
31.25 ; 62,5 ; 125 et 250 µg/ml. Dés lors, la détermination de la
concentration de BSA inconnue dans le puit X peut être déterminée
graphiquement.
Dans notre cas, la concentration recherchée correspond à l’abscisse
62.5 µg/ml.

4- Comparaison des résultats.

Les résultats obtenus concordent parfaitement avec ceux de nos

camarades.